散结镇痛胶囊治疗子宫腺肌症的功效成分和作用机制研究目的:研究散结镇痛胶囊（SZC）治疗子宫腺肌症（AM）的功效成分及作用机制。在研究SZC作用AM模型小鼠的基础上,全面系统分析SZC治疗AM的活性成分和作用靶点;建立稳定可控的化学成分鉴别方法及含量测定方法,结合SZC不同提取物体外抑制人子宫内膜基质细胞侵袭迁移的作用,进一步确定SZC的功效成分,明确SZC对激素、炎症、侵袭迁移等相关靶点表达的影响。方法:1、采用垂体异体移植的方法构建小鼠AM模型,采用HE染色法观察SZC不同剂量组对AM模型小鼠子宫内膜间质或腺体浸润肌层的影响并对浸润程度等级进行评分。2、借助selenium crawler和automated testing框架Web爬虫技术以及python语言设计程序等计算机技术构建网络药理自动分析平台,组合常用化学成分数据库以及疾病靶点数据库检索以及在线分子对接平台,并设置文档上传功能,收录数据库中没有记录的化学成分。通过分子对接结合带权有向算法分析SZC治疗AM的潜在有效成分和潜在作用靶点,实现对关键成分和关键靶点的筛选,以及对SZC治疗AM作用信号通路的GO和KEGG富集分析,并实现对化学成分-作用靶点-信号通路之间网络关系的可视化分析。3、建立UPLC-Q-TOF/MS鉴别SZC中化学成分的分析方法,采用ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm×100 mm,1.8μm）分离,0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液系统梯度洗脱,分别在正、负离子模式下采集质谱信息,根据已建立的SZC化学成分库,进行化学成分信息比对和数据分析,从而鉴别SZC中的化学成分。建立HPLC-DAD-ELSD同时检测SZC中多种化学成分的色谱分析方法,采用Di KMA,Navigatorsil C18色谱柱（100 mm×2.1 mm,2.7μm）分离,甲醇-水流动相梯度洗脱,分析并测定化学成分龙血素A、龙血素B、白藜芦醇、紫檀芪、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd的含量,并对不同溶剂的SZC提取物进行化学成分的检测及含量测定。4、采用免疫组化法检测SZC对AM模型小鼠子宫组织中ER、PR、以及E-cadherin、MMP9蛋白表达的影响。体外培养人子宫内膜间质细胞（h ESCs）,构建激素诱导的h ESCs侵袭迁移模型,采用细胞计数试剂盒法确定SZC不同提取物对h ESCs细胞活力的影响;利用Transwell试验法测定各组药物对细胞侵袭和迁移能力的影响;采用ELISA法检测细胞因子NO、PGE2含量的变化,并收集细胞进行下游激素、炎症以及侵袭迁移相关蛋白的Western blot检测,观察SZC对h ESCs侵袭迁移过程中ER、PR、COX-2、E-cadherin和N-cadherin蛋白表达的影响。结果:1、构建的AM模型小鼠全部发现子宫内膜间质细胞浸润子宫平滑肌内层,并且50%达到Ⅲ级浸润;SZC能够有效抑制垂体移植诱导的AM模型小鼠子宫内膜浸润肌层,降低小鼠子宫内膜浸润等级,其中,低剂量组Ⅱ级浸润比例为50%,中剂量组Ⅱ级浸润比例为17%,0级浸润比例为33%,高剂量组Ⅱ级浸润比例为17%,其余均为Ⅰ级浸润。2、筛选出SZC治疗AM的30个关键活性成分和28个核心作用靶点,预测SZC能够通过影响机体激素调节、炎症反应、细胞黏附、细胞增殖和血管生成产生治疗AM的作用,主要的信号通路包括内分泌抵抗信号通路、PI3K-Akt信号通路、黏附斑信号通路和NF-κB信号通路,各信号通路之间相互交错相互影响。3、建立了UPLC-Q-TOF/MS鉴别SZC中化学成分的分析方法:ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm×100 mm,1.8μm）分离,0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液系统梯度洗脱,梯度条件为0-10 min,15-30%B;10–15 min,30–50%B;15–20 min,50–80%B;20–22 min 80-85%B,流速0.40 m L/min。鉴别出196种SZC的化学成分,其中,来自龙血竭的龙血素A、龙血素B、紫檀芪、白藜芦醇、4’-甲氧基-3’,7-二羟基黄酮、5,7,4’-三羟基黄酮、7,4’-二羟基黄酮、龙血红素A、原儿茶醛;来自三七的DFV、diop、人参皂苷F1等;来自浙贝母的贝母素乙、紫鄂贝碱、龙葵次碱、丁香脂素等,以及来自薏苡仁的2-十六碳烯酸,十八碳二烯酸等经前期网络药理研究被预测为潜在的活性化合物,来自三七的化合物多以代谢产物的形式被预测为潜在活性化合物,例如,人参皂苷Rh2、人参皂苷F1/F2、原人参二醇、人参三醇、人参炔醇、20（R）-人参二醇等。建立了HPLC-DAD-ELSD定量分析方法,经方法学验证,该分析方法稳定可靠:Dikma Navigatorsil C18（100 mm×2.1 mm,2.7μm）色谱柱;流动相为水（A）-甲醇（B）,梯度洗脱:0-18 min,33%-45%B,18-35 min,45%-48%B,35-53 min,48%-55%B,55-65 min,68-70%B;体积流量:0.2 m L/min;检测波长280/325 nm。该方法同时测定了SZC不同溶剂提取液中的八种化合物的含量,75%乙醇是SZC最有效的提取溶剂,龙血素A:龙血素B:白藜芦醇:紫檀芪:三七皂苷R1:人参皂苷Rg1:人参皂苷Rb1:人参皂苷Rd=0.23:0.09:0.84:0.78:1.15:2.70:2.57:0.83;其中,龙血素A、龙血素B、白藜芦醇、紫檀芪经网络药理学研究预测为潜在活性成分;三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rd为网络药理学研究预测的潜在活性成分的原型化合物。4、SZC能够抑制AM模型小鼠子宫ER、PR以及MMP9蛋白的表达,中剂量组的抑制作用显著,具有统计学意义(#P＜0.05,##P＜0.01);低剂量组降低ER和PR的表达水平具有显著差异（#P＜0.05）,SZC能够促进AM模型小鼠子宫E-cadherin蛋白表达,高剂量组升高E-cadherin表达的作用具有显著差异（#P＜0.05）。此外,SZC乙醇组抑制h ESCs侵袭和迁移的作用最强,其次是水提组;各组处理细胞均能降低PR、ERɑ、ERβ、COX-2以及N-cadherin的表达水平,升高E-cadherin的表达水平。其中,石油醚组能够显著升高E-cadherin的表达水平（#P＜0.05）,显著降低ERɑ、ERβ、COX-2的表达水平(###P＜0.001)从而抑制细胞发生迁移,龙血素A和龙血素B为其主要功效成分;正丁醇组能够显著降低N-cadherin的表达水平(###P＜0.001)从而抑制细胞侵袭,三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd为其主要功效成分;乙醇组显著降低PR蛋白表达水平并抑制细胞迁移作用,主要受功效成分龙血素A、龙血素B、白藜芦醇、紫檀芪、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd共同作用的影响。结论:本课题基于SZC在抑制垂体移植诱发AM模型小鼠子宫浸润方面作用显著,通过应用现代计算技术深度挖掘中药大数据,构建自动链接分析平台,对SZC治疗AM的活性成分和作用靶点进行系统全面的分析,预测得到能够揭示其物质基础并起到关键作用的30个化学成分和28个靶点,为其功效成分以及作用机制的深入研究奠定基础。分别建立了简便高效的化学成分鉴别方法和含量测定方法,鉴别出SZC的196种化学成分,并实现同时对SZC的八种成分龙血素A、龙血素B、白藜芦醇、紫檀芪、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd进行定量分析,为研究SZC治疗AM的功效成分提供了技术支持以及为SZC质量控制方法的进一步完善提供依据。此外,体内外药效实验和蛋白表达测定证实了SZC通过升高E-cadherin、降低ERɑ、ERβ、PR、COX-2、N-cadherin、MMP9的表达水平,降低NO、PGE2含量,影响激素抵抗、NF-κB、细胞黏附信号通路,抑制h ESCs的侵袭迁移,抑制子宫内膜、间质细胞及腺体浸润子宫肌层从而治疗AM,验证了PR、ER、ER、COX-2、MMP9为SZC治疗AM的作用靶点。