碱性蛋白酶是一类在生理上、商业上非常重要的酶类。现己广泛应用于洗涤剂、制革及丝绸工业,在医药、食品、环保、银回收、基础研究等领域显示了广阔的应用前景。因此,不断提高碱性蛋白酶生产菌株的发酵活力,大力开展碱性蛋白酶的相关研究有着非常重要的意义。利用复合诱变原生质体技术选育工业新菌种,是一种行之有效的方法,近年来受到国内外普遍重视。 本实验出发菌株为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）S23,其碱性蛋白酶活力为20387μ/mL。本文采用原生质体复合诱变进行菌种选育,并对发酵条件、酶的纯化方法和酶学性质进行了研究。主要研究内容如下: 1.研究了青霉素、溶菌酶、甘氨酸和渗透压稳定剂等因素对原生质体形成和再生的影响,得出原生质体形成及再生最佳条件为:甘氨酸1mg/mL,青霉素0.4μ/mL,加入时间为对数生长中期;溶菌酶添加量2mg/mL,作用温度37℃,作用时间6h;稳定剂为琥珀酸钠,再生培养方法为平板双层法。原生质体形成率和再生率分别达到93.8%和37.5%。 2.研究了原生质体紫外线单因素诱变和UV-EMS复合诱变,最佳实验条件:紫外线单因素处理剂量为3min;紫外线UV-EMS复合诱变剂量为UV照射1min,EMS浓度为30mg/mL;孢子加热选育实验条件为温度80℃,处理时间20min,7%葡萄糖肉汤培养基交替处理。经多次诱变选育,从大量突变株中筛选到一株稳定高产的碱性蛋白酶产生菌SH-59,其活力达到32356μ/mL。 3.对高产菌株SH-59进一步进行了发酵培养基的优化实验,分别研究了碳源、氮源、各种无机盐、培养基起始pH对产酶的影响,并采用正交实验方法,探索了培养基各组成成分对发酵产酶的影响。确定最佳培养基（%）为:玉米粉6.5,豆饼粉4.0,KH₂PO₄ 0.04,Na₂HPO₄ 0.3,CaCl₂ 0.4,pH9.0。同时对摇瓶发酵工艺进行了研究,分别试验了种龄、接种量和装液量对产酶的影响,绘制了发酵过程曲线。确定最适发酵条件为:种龄12h,接种量2%,装液量25ml/250ml,摇床转速210r/min,培养温度37℃,发酵周期44h。酶活达到38925μ/mL。