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黄瓜绿斑驳病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)属烟草花叶病毒属(Tobamovirus),是造成葫芦科作物产量重大损失的病毒之一,在世界各地广泛发生,被列为我国进境植物检疫性有害生物。近年,我国山东、广东、湖北、辽宁等地均有报道,河北葫芦科作物种植区也有发生,并有逐年加重的趋势。为了找到CGMMV有效防治措施,本研究对河北省CGMMV进行分离鉴定,以优势株系CGMMV-chb为研究对象,筛选了症状致弱的弱毒株,构建了侵染性c DNA克隆,为弱毒疫苗的开发奠定了基础。主要研究结果如下:(1)明确了CGMMV河北省分离物分类地位,推测河北省CGMMV优势株系,揭示了优势株系全基因组序列及基因组特征,明确了优势株系的分类地位及系统进化情况。自河北省葫芦科作物种植区采集症状典型的样本,分离纯化获得5株代表性CGMM分离物,以CP基因序列为基础,对5个分离物进行序列比对,并与Gen Bank中其它17个分离物进行序列比对和系统进化关系分析。通过分析河北省5个分离物序列,确定CGMMV优势株系,测定其全基因组序列,与Gen Bank中其它12个分离物进行序列比对及系统进化关系分析。结果表明,河北分离物与中、日、韩三国分离物亲缘关系较近,与希腊CGMMV-GR5、GR3分离物亲缘关系最远;河北省5个分离物中,CGMMV-chbz、CGMMV-chbx和CGMMV-chbl 3个分离物CP核苷酸和氨基酸序列相似性为100%,推测为河北省优势株系;将河北省优势株系进行全基因组序列测定,定名为CGMMV-chb(Gen Bank Acc.No.KJ658958),基因组全长6424nts,含有4个开放阅读框,编码4种蛋白,包括靠近5′端128.7 k Da、186.4 k Da复制酶蛋白、28.9 k Da的运动蛋白和17.4 k Da的外壳蛋白;CGMMV-chb与其它中国分离物、日韩分离物亲缘关系较近,与以色列分离物亲缘关系相对较远。(2)获得2株CGMMV-chb弱毒株。将CGMMV-chb野生株系采用热处理、亚硝酸处理、复合处理3种方法进行人工诱变,接种苋色藜(chenopodium amaranticolour),分离小型枯斑,接种黄瓜寄主,筛选无症分离株。通过毒力稳定性、病毒增殖速率、寄主范围的测定确定CGMMV-chb弱毒株。结果表明,经三种方法诱变获得明显变小的127个枯斑,接种系统寄主黄瓜,获得不表现症状、RT-PCR检测为阳性的2株致弱株,编号为066和113。连续反复接种苋色藜与黄瓜幼苗4代,验证了弱毒株毒力稳定。采用半定量RT-PCR揭示CGMMV-066与CGMMV-113增殖速率均比野生株系慢且含量低。两株弱毒株寄主范围与强毒株相比并无显著差别。CGMMV-066和CGMMV-113均可作为后续筛选弱毒疫苗的研究对象。(3)构建了CGMMV-chb侵染性c DNA克隆。首先将CGMMV-chb全基因组序列克隆到p UC19载体上,然后单酶切线性化,将线性化载体作为模板进行体外转录,最后验证体外转录产物与子代病毒的侵染性。结果表明,CGMMV全基因组序列准确克隆到p UC19载体上,体外转录产物在枯斑寄主苋色藜和系统寄主黄瓜上表现症状与野生病毒相同,子代病毒表现相同症状。经RT-PCR与western-blot方法检测染病植株,呈现阳性结果,证明了侵染性克隆的侵染性。