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目的:利用重组腺病毒载体Ad E-GFP-h TSHR289诱导小鼠GD模型,并初步探讨mi R-346对GD小鼠Tfh细胞的影响。方法:(1)利用电转化的方法将腺病毒骨架质粒转化至E.coli BJ5183中,获得含有腺病毒骨架质粒的E.coli BJ5183(E.coli BJ5183-p),之后将E.coli BJ5183-p制备成化学感受态。(2)利用限制性内切酶技术将h TSHR289插入携带GFP基因的p Ad Track-CMV中,然后将重组后的质粒p Ad Track-h TSHR289转化至感受态E.coli BJ5183-p,利用E.coli BJ5183的重组酶活性,腺病毒骨架质粒和p Ad Track-h TSHR289实现同源重组,得到了携带有目的基因的重组腺病毒骨架质粒(p Ad Easy-GFP-h TSHR289),进一步将此质粒转化至感受态E.coli DH5α中,制备大量拷贝的腺病毒质粒。Pac I酶切p Ad Easy-GFP-h TSHR289,将其转染到人胚肾293A细胞,1-2天后,倒置荧光显微镜下可见293A细胞表达绿色荧光蛋白,初步判断其转染效率。(3)大量扩增重组的腺病毒,TCID50法检测重组腺病毒滴度。在第0、3、6周通过肌肉注射腺病毒免疫刺激雌性BABL/c小鼠。于第10周取小鼠眼球血,ELISA方法检测小鼠血清TRAb和T4水平,同时取甲状腺组织做病理学检查。(4)流式细胞术检测小鼠脾脏和颈部淋巴结Tfh细胞比例。(5)第0、4、8、12、16天,尾静脉注射mi R-346到GD小鼠体内,于第18天处死小鼠,ELISA方法检测小鼠血清TRAb和T4水平,流式细胞术检测小鼠颈部淋巴结中Tfh细胞的比例,并与对照小鼠进行比较。结果(1)通过酶切,转接和测序验证,得到重组质粒p Ad Easy-GFPh TSHR289,通过人胚肾293A细胞包装得到了重组腺病毒(Ad E-GFPh TSHR289)。(2)重组腺病毒具有高滴度和高感染性,TCID50法测得Ad EGFP-h TSHR289的滴度为3.5×109 pfu/ml,Ad E-GFP-CMV的滴度为2.4×109 pfu/ml;ELISA结果显示,与对照组小鼠相比,腺病毒Ad EGFP-h TSHR289处理组小鼠,80%的血清中TRAb水平明显升高(p<0.001),60%的血清T4水平升高(p<0.01);甲状腺病理切片显示,实验组小鼠的甲状腺细胞轻度增生,滤泡内胶质明显减少。(3)与对照组小鼠相比,GD小鼠颈部淋巴结中Tfh细胞的比例是显著增加的(p<0.05),而脾脏中则无显著变化。(4)GD小鼠在mi R-346干预后,与对照组相比,小鼠血清中TRAb和T4水平都出现显著性降低(TRAb:p<0.05;T4:p<0.01)并且小鼠颈部淋巴结中Tfh细胞的比例也有所下降(p<0.05)。结论(1)利用Adeasy系统得到携带h TSHR289的重组腺病毒骨架质粒,通过人胚肾293A细胞包装得到了重组腺病毒。(2)重组腺病毒能够成功诱导BALB/c小鼠GD的发生。(3)GD小鼠颈部淋巴结中Tfh显著增加。(4)mi R-346能够下调Ad E-GFP-h TSHR289诱导的GD小鼠自身抗体的水平。(5)mi R-346能够抑制GD小鼠颈部淋巴结Tfh细胞比例的增多。