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近年来,由肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)引起的上、下呼吸道感染有呈逐年上升的趋势,并且耐药性也逐年增加。国外人体临床试验发现灭活疫苗免疫后引发感染加重,且保护率低,至今尚未研发成功MP疫苗。通过体外传代筛选免疫原性强、毒力低的毒株,对于探索MP疫苗具有重要意义。[目的]将MP在体外连续传代,测定其毒力、免疫原性、免疫保护性及其基因序列的变化,为肺炎支原体疫苗的开发奠定基础。[方法]将MP(ATCC 15531T)在体外连续传代培养至130代,每代进行菌株保藏。对体外传代后的MP进行生长特性研究:①通过对MP进行固体培养基培养,观察MP菌落形态变化;②不同代次MP生长曲线绘制;③不同代次MP菌数测定。每隔十代将MP菌液鼻内感染Balb/c雌性小鼠,通过计算小鼠肺组织中MP活菌数、湿重肺指数和组织病理学评分(histopathologic score,HPS),统计学比对分析,判定不同代次MP毒力。选取毒力相关基因(p1、p30、p40、p90、p24、p41、p200、p65、mpn387、hmw1、hmw2、hmw3、top j、、cards、mpn491和glp d),对不同代次 MP 进行基因测序,查找毒力变化相关位点。通过皮下免疫和鼻内免疫这两种免疫方式,将第5代、60代、70代和130代肺炎支原体分别将MP 5、MP 60、MP 70和MP 130免疫Balb/c雌性小鼠,然后用MPATCC 15531T第5代进行攻毒;通过测定血清中抗体效价评价免疫原性,及感染后肺组织中MP活菌数、计算湿重肺指数和组织病理学评分进行免疫保护力评定。[结果]MP经过体外传代培养后MP菌落形态未发生变化,都呈现“油煎蛋”形。从生长曲线和不同代次菌数测定可以看出,肺炎支原体经过体外传代后,菌数增多,初始菌(MP 1)数为 6.57±0.208X 106 CFU/mL,MP 50 菌数为 1.98±0.0727X 107 CFU/mL,到了 60 代时菌数为 2.34±0.0416X 108 CFU/mL,MP 70-130 稳定在 2～4×108 CFU/mL.MP经过体外传代培养后毒力测定:用不同代次对Balb/c小鼠进行感染,阳性对照组肺组织活菌数为1.062×104 CFU/mL,MP 50感染后活菌数为9.676X 103 CFU/mL,湿重肺指数(1.05%)、组织病理学评分(2.6)与阴性对照组(分别为0.73%,1.0)都有极显著差异(p<0.01)。MP 60毒力略有降低,感染后活菌数为1.151 ×103 CFU/mL,但是湿重肺指数(0.99%)、组织病理学评分(2.0)与阴性对照组有极显著差异(p<0.01)。MP70-130毒力明显降低,感染后MP活菌数少于10 CFU/mL,湿重肺指数(0.77%)、组织病理学评分(1.0)与阴性对照组无显著差异(p>0.05)。体外传代培养后,p1、p30、p40、p90、p24、p41、p200、p65、mpn387、hmw1、hmw2、hmw3、top j未发生基因突变。通过体外传代培养60代,编码MPN491第64位氨基酸的序列替换为终止密码子。体外传代培养70代,编码HMW1第810位氨基酸的序列替换为终止密码子。这两个基因的变化是否与MP体外连续传代减毒有关需要进一步研究。通过鼻内免疫1次后测抗体效价判定MP的免疫原性,MP60、MP70、MP 130免疫后GMT都为5.25,与MP5(GMT为8.10)无显著统计学差异(p>0.05)。鼻内和皮下注射免疫后进行攻毒试验:MP 5、MP 60、MP 70和MP 130鼻内免疫后湿重肺指数(0.92-0.98)、HPS(2.4-3.0)与阴性对照组(分别为0.73%,1.0)都有极显著差异(p<0.001),无保护效果。皮下免疫后湿重肺指数(0.91-0.99)、HPS(1.4)与阴性对照组(分别为0.83%,1.0)都无显著性差异(p>0.05),说明MP体外连续传代皮下免疫后具有保护效果。通过组织病理学切片评分进一步计算皮下免疫后对肺炎的保护率,MP 5皮下免疫后保护率为50%,MP 60、MP 70和MP 130皮下免疫后保护率都为60%。测定攻毒后肺组织中MP活菌数,发现鼻内和皮下免疫都能清除部分攻毒时进入MP:鼻内免疫时,MP5免疫能清除93.97%的MP,MP60免疫能清除97.91%的MP,MP 70免疫后清除MP的能力降低,只能清除63.27%的MP。皮下免疫后MP5免疫只能清除65.76%的MP,MP60、MP70和MP130免疫后清除率分别为73.42%、64.43%和78.9%。表明皮下免疫对MP的清除能力相较于鼻内免疫有所降低。[结论]1.MP通过体外连续传代培养,菌落形态未发生变化,细胞数量从6×106 CFU/mL 提升到4×1 08 CFU/mL。2.MP通过体外连续传代培养,MP60毒力略有降低,MP70-130感染Balb/c小鼠后湿重肺指数、组织病理学评分与阴性对照无显著性差异(p>0.05),毒力明显降低。3.MP体外传代培养至60代时,编码MPN491第64位氨基酸的序列替换为终止密码子。体外传代培养至70代时,编码HMW1第810位氨基酸的序列替换为终止密码子。4.MP 60、MP 70和MP 130通过皮下免疫的方式免疫Balb/c小鼠仍有60%的保护率;而用鼻内免疫虽然清除MP的效果好,但炎症未减轻。