为研究不同砧木脐橙对冷害胁迫的响应,明确其响应胁迫时叶部代谢产物差异和特征化合物及主要代谢途径,本研究分别以一年生枳壳(Poncirus trifoliata(L.)Raf.)和枳橙(Citrus.sinensis(L.)Osbeck×P.trifoliata(L.)Raf.)作为砧木与一年生纽荷尔脐橙(C.sinensis Osbeck)嫁接,嫁接10个月后进行4℃冷害胁迫实验,分别在胁迫0,24,72,120 h采摘上、中、下部位的叶片为实验材料,利用静态顶空气相色谱-质谱联用(SHS-GC-MS)技术检测其挥发性化合物,电喷雾萃取电离质谱法(EESI-MS)和超高效液相串联四级杆飞行时间质谱法(UPLC-Q-TOF-MS)检测非靶向代谢产物,高效液相检测酚类化合物。并利用主成分分析(PCA)和聚类分析(CA)等化学计量学方法对数据进行处理,分析差异化合物,并对代谢物进行了定性。主要研究结果如下。1.砧木为枳橙的脐橙苗24 h时表现出叶片微卷曲,72 h时叶片明显卷曲,120 h时叶片卷曲加剧且顶芽萎蔫。砧木为枳壳的脐橙苗24 h和72 h时没有明显表型变化,120 h时叶片卷曲。以枳壳作为砧木的脐橙苗对冷害表现出更强的耐受性。2.SHS-GC-MS共鉴定出213种化合物,主要包括萜烯、酯类、醇、醛、氨基酸和烷烃类化合物。两种脐橙苗每个时期都含有的物质有氨基甲酸、α-水芹烯、γ-萜品烯、α-萜品烯、蒈烯、(+)-蒈烯、D-柠檬烯、新异长叶薄荷醇、醋酸萜品酯、(±)-α-醋酸萜品酯、癸醛、香芹醇、2-甲基-萘、2-亚甲基-4,8,8-三甲基-4-乙烯基-双环[5.2.0]壬烷。胁迫处理不同时间砧木为枳橙的脐橙苗成分较枳壳变化更大,其中变化显著的物质有α-水芹烯和γ-萜品烯。冷害胁迫下两种脐橙挥发性化合物的标记物为萜烯类化合物。砧木为枳橙上部叶的差异化合物为4-亚甲基-1-(1-甲基乙基)-环己烯、罗勒烯、新异长叶薄荷醇、(+)-蒈烯和β-半水芹烯等,中部叶的差异化合物为α-水芹烯、γ-萜品烯、(-)-β-蒎烯、蒈烯和D-柠檬烯等,下部叶的差异化合物为(±)桧烯、4-亚甲基-1-(1-甲基乙基)-环己烯、2-侧柏烯、γ-萜品烯和(-)-β-蒎烯。砧木为枳壳上部叶的差异化合物为(±)桧烯、β-半水芹烯、γ-萜品烯、4-亚甲基-1-(1-甲基乙基)-环己烯和2-侧柏烯,中部叶的差异化合物为γ-萜品烯、(±)桧烯、4-亚甲基-1-(1-甲基乙基)-环己烯、α-水芹烯和2-侧柏烯,下部叶的差异化合物为α-水芹烯、γ-萜品烯、新异长叶薄荷醇、β-半水芹烯和4-亚甲基-1-(1-甲基乙基)-环己烯。3.利用PCA分析EESI-MS数据,结果表明两种砧木脐橙苗的上部和下部叶在不同时间均无法区分开,而中部叶在胁迫后可区分,说明相对于上和下部叶,中部叶在脐橙应对冷害胁迫时最敏感。砧木为枳橙的脐橙中部叶在不同胁迫时间可以完全区分开,PC1贡献率达53.8%,砧木为枳壳的脐橙叶在0,24,72h之间可以完全区分开,而120 h处理下与另外三个处理之间都有部分交联,PC1贡献率达74.2%。说明冷害胁迫下砧木为枳橙的脐橙叶代谢变化较大;而砧木为枳壳的脐橙叶在胁迫后可能启动了某些调控机制,代谢产物变化不明显。根据二级质谱离子碎片并结合谱库比对化合物,鉴定出的差异物质有4-氨基丁酸(m/z104)、1-壬醇(m/z 144)、L-脯氨酸(m/z 116)、苹果酸(m/z 135)、辛弗林(m/z168)、焦谷氨酸(m/z 130)和木糖醇(m/z 153)。4.利用UPLC-Q-TOF-MS检测中部叶醇提物,共鉴定出35种化合物,包括有机酸、糖类和酚类化合物等。对两种脐橙中部叶化合物进行PCA分析,都可以完全区分开且有较高贡献率。其中砧木为枳壳的脐橙中PC1排名前20的物质鉴定出7种化合物,分别为山奈黄素-7-O-新橙皮糖苷、山奈黄素-3-葡糖苷-2-对-香豆、2-{2-苯并咪唑-2-基-1-[(4-甲基苯基)甲基]乙基}苯并咪唑、橙皮苷、屈大麻酚、异夏佛塔苷和果糖2,6-二磷酸酯。砧木为枳橙的脐橙中PC1排名前20的物质鉴定出5种化合物,分别为1-O-β-d吡喃葡糖基芥子、橙皮苷、野漆树苷、蔗糖和2-{2-苯并咪唑-2-基-1-[(4-甲基苯基)甲基]乙基}苯并咪唑。5.HPLC结果表明,不同砧木的脐橙叶酚类化合物含量及冷害胁迫下酚类物质的变化有很大差别。共鉴定出11种酚类化合物,包括原儿茶酸、咖啡酸、槲皮素、柚皮素、山奈酚、橙皮素、绿原酸、阿魏酸、芸香叶苷、杨梅素和肉桂酸。砧木为枳壳的脐橙叶酚类化合物除咖啡酸外其他物质都在冷害胁迫24 h时达到最大值,这10种化合物在胁迫后期含量降低且与对照无显著性差异。可能是砧木为枳壳的脐橙受到冷害胁迫后启动调控机制,因而恢复至正常状态。砧木为枳橙的脐橙叶酚类化合物变化不规律。综上所述,砧木为枳壳的脐橙比砧木为枳橙的对冷害更不敏感,表现更耐寒。EESI-MS揭示中部叶在冷害胁迫下变化更明显,其主要差异物质有4-氨基丁酸、1-壬醇、L-脯氨酸、苹果酸、辛弗林、木糖醇和焦谷氨酸等。挥发性成分的差异物质主要为萜烯类化合物。HPLC鉴定出11种酚类化合物,所含酚类物质的种类差别不大,但含量变化各不相同。