三萜化合物是广泛存在于植物中的一大类次生代谢产物,是许多天然药物的药效物质基础,具有溶血、抑菌、消炎、抗肿瘤、抗癌、抗病毒、降低胆固醇等多种药理活性。三萜种类繁多,自然界常见的三萜主要有四环三萜——大戟二烯醇及其同分异构体表大戟二烯醇和五环三萜——羽扇豆醇等。2,3-氧化鲨烯为三萜和甾醇合成的共同前体,其可被不同的氧化鲨烯环化酶(oxidosqualene cyclase,OSC)环化形成构型和功能各异的三萜和甾醇。挖掘植物三萜生物合成途径上的关键基因有助于在分子水平上解析其合成机制,为构建高效的三萜微生物合成平台提供基因元件。目前对药用植物三萜合成途径的研究甚少,大戟科植物绿玉树(Euphorbia tirucalli L.)具有重要的药用和能源价值,其中含有大戟二烯醇等许多活性三萜成分。本研究以其为研究材料,构建了不同部位的转录组文库,通过转录组数据分析筛选了与三萜合成密切相关的代谢通路和功能基因,并对其关键氧化鲨烯环化酶基因进行功能验证。同时以羽扇豆醇为指标化合物,筛选最优合成基因和工程菌株,实现三萜在微生物中的异源高效合成。研究成果包括以下3个部分:(1)绿玉树转录组测序及氧化鲨烯环化酶基因的挖掘:代谢产物分析表明绿玉树中三萜和甾醇的生物合成具有特异性:大戟二烯醇和表大戟二烯醇在乳胶中大量积累,而β-谷甾醇却不能在乳胶中积累。利用Illumina HiSeq X Ten测序平台对其进行转录组测序,共计22.87 G nt原始数据。de novo组装获得绿玉树根、茎、叶和乳胶的转录组,得到91,619条Unigenes,其中51.08%得到NR数据库功能注释。通过对绿玉树转录组数据分析,总共有2922条与次生代谢物途径相关的Unigenes在乳胶中相对高表达。乳胶上游通路(除MEP途径)绝大多数基因转录水平上调导致乳胶中大戟二烯醇的大量积累。不同部位中基因表达的差异导致了三萜和甾醇生物合成的特异性。同时筛选到7条氧化鲨烯环化酶编码基因,其中EtOSC5和EtOSC6在乳胶中明显上调表达,很可能与大戟二烯醇和/或表大戟二烯醇合成有关。(2)绿玉树氧化鲨烯环化酶EtOSC5和EtOSC6的功能解析:将假定的绿玉树氧化鲨烯环化酶编码基因EtOSC5和EtOSC6引入羊毛甾醇缺陷型酿酒酵母GIL77中进行异源表达及功能验证,表明EtOSC5和EtOSC6均为多功能氧化鲨烯环化酶。EtOSC5能环化2,3-氧化鲨烯生成四环三萜大戟二烯醇和表大戟二烯醇,其产量分别为0.81 mg/L和0.41 mg/L。EtOSC6能环化2,3-氧化鲨烯生成五环三萜β-香树脂醇和蒲公英甾醇,其产量分别达到0.53 mg/L和1.74 mg/L。EtOSC5氨基酸序列中的E123、F261和I534位点的活性显著影响大戟二烯醇的产量,而对表大戟二烯醇形成的影响相对较小。将EtOSC5氨基酸序列中的LADQ(475-478)突变为FSTA(475-478)后,突变体生成的新产物可能为大戟二烯醇、表大戟二烯醇和羊毛甾醇的同分异构体。EtOSC6氨基酸序列中的NL(415-416)两个连续位点的催化活性影响中间体Germanicyl cation的后续质子重排,对蒲公英甾醇的合成有显著的影响。将其替换为FS(415-416)后,突变体仅能合成β-香树脂醇。(3)羽扇豆烷型三萜微生物合成平台的建立:将不同来源的羽扇豆醇合成通路中的基因(SQS、SE和LUP)基于宿主密码子偏好性进行优化合成,将其分别导入大肠杆菌或酿酒酵母体内进行生化功能验证,筛选出的最优合成基因为嗜热蓝藻Thermosynechococcus elongatus BP-1的tSQS、大鼠的rSE和油橄榄的OeLUP。将筛选的最优基因导入大肠杆菌体内重构羽扇豆醇的合成通路,仅能够检测到微量羽扇豆醇的生成。将筛选的最优基因导入酿酒酵母WAT11和EPY300体内重构羽扇豆醇的合成通路,最终获得共表达tSQS、rSE和OeLUP的重组酿酒酵母EPY300菌株(ECTROe菌株),其在30°C下培养72 h时羽扇豆醇的最高产量可达225.7 mg/L,比之前报道的NK2-LUP酵母工程菌产量提高了27倍。本论文首次从绿玉树中分离获得催化大戟二烯醇、表大戟二烯醇和蒲公英甾醇形成的氧化鲨烯环化酶基因。两种新型氧化鲨烯环化酶基因EtOSC5、EtOSC6的发现将有助于植物氧化鲨烯环化酶多态性的研究,为解析氧化鲨烯环化酶环化机制提供新的依据。工程菌大肠杆菌和酿酒酵母是两种公认的“微生物工厂”,很多植物来源的具有生理活性的化合物都以二者为宿主菌实现了异源高效合成。本论文首次在原核宿主中实现了羽扇豆醇的生物合成;并且在真核宿主中,通过最优通路基因和工程菌的筛选以及最优基因的组合表达,获得了高产羽扇豆醇的酿酒酵母工程菌株ECTROe。两种羽扇豆醇工程菌的构建为后续的三萜生物合成的改造提供了新的参考。