双黄连注射液(SHLI)在临床上用于治疗上呼吸道感染尤其是病毒性感染疗效很好,然而由于时有过敏样反应发生,使其临床应用受限。本研究的目的是对SHLI的急性过敏样反应进行深入研究,明确其主要特点,找出致敏物质,探讨其致敏机制,从而为SHLI工艺优化、质量控制和临床安全用药提供基础。本论文主要由两部分构成：文献综述和实验研究,实验研究包括SHLI过敏样反应特点、SHLI类过敏物质研究和SHLI类过敏反应炎性机制研究。1.文献综述：包括①双黄连注射液不良反应研究进展；②CD4+CD25+Foxp3调节性T细胞功能研究进展。本部分主要从这两个方面对相关文献进行了归纳整理和总结提炼,从而为本研究的开展提供了思路和相关指导。2.实验研究2.1SHLI过敏样反应特点研究本研究采用豚鼠主动过敏试验(ASA试验)和大鼠被动皮肤过敏试验(PCA试验)对SHLI进行致敏性评价研究,并以本实验室前期建立的小鼠类过敏试验和大鼠被动皮肤过敏试验对SHLI进行致类过敏作用研究。ASA试验中,用不同剂量SHLI(加佐剂和不加佐剂)对豚鼠进行腹腔致敏,隔日一次,共致敏三次,末次致敏后14天,静脉注射致敏剂量两倍的SHLI进行激发,结果致敏豚鼠出现明显的过敏症状。为了区分类过敏反应,直接给未致敏豚鼠静脉注射与激发剂量相同的SHLI,豚鼠出现与致敏反应中相似的过敏症状。豚鼠耳和肺组织病理结构都显示以炎症改变为主。PCA试验中,采用与ASA试验相同的致敏方式对BN大鼠进行致敏,分别于末次致敏后10天、14天、17天和21天取致敏大鼠血清,稀释不同滴度后皮内注射到正常Wistar大鼠背部皮肤,24h后给Wistar大鼠静脉注射与致敏剂量相同的SHLI和伊文思蓝(EB)混合溶液进行激发,结果注射SHLI致敏血清局部未出现明显蓝斑。小鼠类过敏反应中,在SHLI受试物中加入EB生理盐水溶液给ICR小鼠静脉注射,然后通过耳廓蓝染发生率和蓝染面积评分及耳廓中EB含量判断血管通透性增高的程度从而了解其诱发类过敏反应程度。由结果可知,小鼠耳廓发生明显蓝染,并具有剂量相关性。另外小鼠耳和肺组织病理改变与豚鼠相似,以炎症改变为主,耳组织超微结构显示类过敏反应的病理基础是血管通透性增高。大鼠皮肤类过敏试验：本研究采用改良的Miles分析方法,即采用静脉注射0.6%伊文思蓝作为血管渗出的指示剂,观察了皮内注射不同浓度SHLI后局部血管渗出表现。结果显示,随着SHLI浓度增大,注射SHLI局部皮肤的蓝斑也逐渐增大。Beagle犬类过敏试验中,分别一次性静脉注射临床2倍和4倍浓度的SHLI后,Beagle犬出现了明显的过敏样反应症状,且随着浓度的升高,症状明显加重,而且4倍浓度时,血压出现了即刻下降,在给药后2小时才缓慢恢复到正常。综合以上试验结果分析,SHLI主要诱发类过敏反应,其组织病理变化以炎症反应为主,血管通透性增高是其发生的病理基础,类过敏反应的发生及程度与浓度和剂量过高具有明显正相关。由于ASA和PCA试验的敏感性和局限性,所以SHLI的过敏试验结果仅供参考。2.2SHLI类过敏反应物质研究本研究借助小鼠类过敏评价模型对SHLI致类过敏物质进行筛选。首先将与SHLI中含量相同的SHLI三种主要药效成分黄芩苷、绿原酸和连翘苷的EB混合溶液分别静脉注射入小鼠体内,结果各组小鼠耳廓均未见明显蓝染。下一步又对黄芩提取物、金银花提取物和连翘提取物三种中间体进行了致类过敏反应研究,方法与前相似,结果显示连翘提取物可使小鼠发生明显类过敏反应,所以连翘提取物中可能存在致类过敏物质。接下来用化学萃取手段对连翘提取物的不同极性部位进行了萃取,将四个部分的萃取物包括氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取提取物分别注射入小鼠体内,按照类过敏评价方法对其致类过敏作用进行评价,结果显示类过敏反应最强部位为正丁醇部分。然后采用液质联用技术对正丁醇部位的活性成分进一步分离和鉴定,共分离出11个酚类化合物,最后选择了连翘苷、连翘酯苷A、连翘酯苷E、牛蒡苷进行致小鼠类过敏反应研究,结果显示,连翘酯苷A可导致小鼠发生明显的类过敏反应,并且进一步研究表明,连翘酯苷A的致致类过敏作用具有明显剂量效应关系。2.3SHLI类过敏反应炎性机制研究将致敏剂量的SHLI给予ICR小鼠静脉注射,5min后取小鼠血浆和肺组织,通过ELISA方法检测血浆和肺匀浆液中的组胺含量,30min后再取类过敏小鼠血清和肺,ELISA方法检测其中的VEGF、TNF-α和IL-10等细胞因子含量,结果显示,血浆和肺组织组胺含量都明显升高。运用抗组胺药氯雷他定对小鼠进行预防给药,再静脉注射SHLI,小鼠类过敏反应明显减轻。另外检测了SHLI对肥大细胞系RBL-2H3细胞的脱颗粒刺激作用,显示SHLI可刺激RBL-2H3细胞脱颗粒释放组胺等活性物质。血清内的VEGF含量也有升高趋势,其它细胞因子未见明显改变。另外将致敏剂量的SHLI作用于白细胞减少模型(注射环磷酰胺)、T淋巴细胞缺失小鼠(Balb/c和SCID小鼠)及不同T细胞亚群移植(免疫磁珠细胞分选)免疫重建SCID小鼠模型,结果显示白细胞减少的ICR小鼠比未减少小鼠类过敏反应轻,T淋巴细胞缺失小鼠则不发生类过敏反应,不同亚群T细胞移植SCID小鼠对SHLI的类过敏反应不一样,CD4+CD25T细胞和CD4T细胞移植小鼠发生明显的类过敏反应,并且小鼠体内炎性细胞因子也明显升高。CD4+CD25+Treg细胞移植小鼠则没有发生明显类过敏反应。以上试验结果证实SHLI可通过直接刺激肥大细胞释放组胺导致类过敏反应,组胺受体拮抗剂可以缓解这种反应。SHLI还能激活T细胞从而释放一系列炎性因子(包括IL-5、IL-6等)发挥致类过敏作用,CD4+CD25+Treg能抑制CD4和CD8细胞功能从而抑制SHLI的类过敏反应。以上均说明炎性机制在SHLI的类过敏反应中起着重要作用。3.结论(1)初步证明SHLI的过敏样反应特点主要为类过敏反应,炎性改变和血管通透性升高是其主要组织病理学机制。(2)连翘酯苷A可能是SHLI主要致敏物质,其致敏特点具有剂量效应关系。(3)直接刺激肥大细胞释放组胺可能是SHLI类过敏反应的主要原因,另外,白细胞尤其是淋巴细胞也部分介导了SHLI的类过敏反应。SHLI还可以激活T淋巴细胞,T淋巴细胞通过释放一系列炎性因子(包括TNF-α、IL-5、IL-6等)来发挥致类过敏作用,CD4+CD25+Treg细胞可能能抑制SHLI的类过敏反应。