研究背景与目的结直肠癌(Colorectal cancer)是发病率最高的恶性肿瘤之一,2018年的全球流行病学调查显示其发病率在所有癌症中排名第三。约90%的结直肠癌患者死于肿瘤的转移。深入探讨结直肠癌转移的机制,对降低结直肠癌的死亡率有着重要的科学价值。肠道微生态与结直肠癌的发生密切相关。具核梭菌(Fusobacterius nucleatum)是主要存在于口腔黏膜的革兰氏阴性专性厌氧菌,近年来被报道在结直肠癌的发生中起到了重要的作用。有临床数据显示具核梭菌的丰度与结直肠癌的淋巴结转移远处转移相关。但是具核梭菌的异常定植是否直接驱动结直肠癌的转移目前尚不明确。本研究将深入探索具核梭菌在结直肠癌转移过程中所起到的作用其机制,为结直肠癌的治疗提供潜在的新靶点。研究内容和方法1.收集结直肠癌患者与健康人群的粪便样本,通过实时荧光定量PCR方法检测并比较患者与健康人群肠道中具核梭菌的丰度,并分析患者肠道具核梭菌丰度与淋巴结转移的相关性。2.将具核梭菌与结肠癌细胞共培养后,通过体外细胞实验(transwell迁移实验和划痕实验)与体内实验(结肠癌细胞裸鼠尾静脉注射肺转移模型)分析具核梭菌对结肠癌细胞转移能力的影响。3.通过RNA测序技术分析具核梭菌对结肠癌细胞长链非编码RNA(lnc RNA)和m RNA表达谱的影响,从中筛选出了义lnc RNA KRT7-AS其正义链的编码基因KRT7,并通过实时荧光定量PCR、免疫印迹、细胞免疫荧光实验验证测序结果。4.分别敲减或者过表达KRT7-AS或者KRT7,通过实时荧光定量PCR、western blot分析KRT7-AS与KRT7的相互作用关系;通过体外细胞实验(transwell迁移实验和划痕实验)与体内实验(结肠癌细胞裸鼠尾静脉注射肺转移模型)分析KRT7-AS与KRT7对结肠癌细胞转移能力的影响。5.分析TCGA数据库中结肠癌患者和浙江大学附属邵逸夫医院结直肠癌手术患者癌与癌旁正常组织KRT7-AS与KRT7的表达水平其表达与淋巴结转移的相关性。6.通过软件预测可能与KRT7-AS启动子结合的转录因子,结合我们的RNA测序结果,筛选出调控KRT7-AS的转录因子,结合实时荧光定量PCR,免疫印记、荧光素酶报告基因实验进一步验证该转录因子对KRT7-AS的转录调控。研究结果1.结直肠癌患者粪便中具核梭菌丰度较正常人显著增加。结直肠癌伴淋巴结转移患者较无伴有淋巴结转移患者粪便中具核梭菌增多。2.Transwell细胞迁移实验和划痕实验证明具核梭菌共培养可以促进结肠癌细胞的迁移功能。而加热灭活的具核梭菌并不能促进结肠癌细胞的迁移功能。结肠癌细胞裸鼠尾静脉注射肺转移模型结果显示具核梭菌能促进结肠癌细胞的远处转移能力。3.RNA测序结果显示具核梭菌感染后义lnc RNA KRT7-AS与其正义链的编码基因KRT7的表达均显著上调。通过实时荧光定量PCR、western blot、细胞免疫荧光实验进一步验证得出具核梭菌可以上调lnc RNA KRT7-AS m RNA KRT74.lnc RNA KRT7-AS能正向调控KRT7的表达;过来KRT7并不能调控KRT7-AS的表达。体内与体外功能实验结果证明KRT7-AS与KRT7可以促进结肠癌细胞的转移。过表达KRT7能够恢复由于敲减KRT7-AS而被抑制的细胞迁移功能,表明KRT7-AS通过上调KRT7促进结肠癌细胞转移。具核梭菌能促进KTR7-AS正常表达的结肠癌细胞的远处转移能力,但是并不能显著促进KRT7-AS稳定敲减的结肠癌细胞的远处转移能力,表明具核梭菌促进结肠癌转移能力与其对KRT7-AS的调控相关。5.KRT7-AS和KRT7在结直肠癌患者的癌组织中表达较正常组织明显升高。而且KRT7-AS和KRT7的表达呈正相关。KRT7-AS和KRT7的高表达与结直肠癌患者淋巴结转移相关。6.对RNA测序结果进行信号通路富集分析,显示具核梭菌可以激活NF-κB信号通路,并且该结果通过western blot和细胞免疫荧光实验得到了证实。软件预测结果显示KRT7-AS启动子区域存在NF-κB p65的结合位点。使用NF-κB小分子抑制剂或者是NF-κB si RNA敲减NF-κBp65均能抑制KRT7-AS的表达。荧光素酶报告基因实验证实NF-κB可以调控KRT7-AS启动子的转录活性。而抑制NF-κB信号通路后,具核梭菌共培养不能有效上调KRT7-AS。研究结论1.具核梭菌促进结直肠癌的转移。2.具核梭菌可以上调义lnc RNA KRT7-AS,KRT7-AS进一步促进m RNA KRT7的表达,从而促进结直肠癌的转移。3.具核梭菌通过激活NF-κB信号通路,而激活的NF-κB可以通过转录调控促进KRT7-AS的表达。