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海参体内的活性多糖能够提高机体免疫力,具有抗血栓、抗肿瘤、抗凝血、降低血清胆固醇等功效。目前,国内海参产品主要有海参鲜品、传统海参干品、深加工的海参食品。而传统海参干品仍占据着市场。在干海参的生产过程中,通过煮制鲜海参,产生了大量废液。这些废液含有海参多糖等功效成分,被企业不经处理就排放入海。从海参加工废液中提取海参多糖,不仅能降低生产成本,为企业带来巨大的经济效益,还将减少由废液处理不当所造成的环境污染。
本文首先研究了苯酚硫酸法测定海参多糖的准确性和影响因素,找出了该方法在测定应用中的缺陷,探索了海参多糖特异性显色的影响因素,建立了准确测定海参多糖含量的天青试剂Ⅰ显色-分光光度测定方法。其次,以海参加工废液为原料,利用超滤、喷雾干燥、SFE、酶解、醇沉的工艺除去杂质,确定了提取海参多糖的最佳工艺,并通过活性炭脱色、醋酸钾溶液沉淀多糖、凝胶柱层析纯化得到精致多糖。最后,对所提取海参多糖进行了急毒性实验和免疫调节作用的研究。
结果如下:
1.确定了苯酚硫酸法的最大吸收波长为488.73nm,并建立了苯酚硫酸法测定多糖的标准曲线,A=4.5013x+0.001,R2=0.9997。但是本方法测定样品中海参多糖的含量,数据波动大。进一步试验发现,苯酚硫酸法不适合海参多糖含量的测定。在此基础上,探索了样品前处理对本方法测定海参多糖的影响,结果是乙醇沉淀多糖这一步骤对实验结果影响很大。另外,样品中存在的葡萄糖、蛋白质在测定时之前必须除去,它们对结果影响值接近1∶1。
2.建立了海参多糖特异性显色法测定海参多糖,其最大吸收波长为547nm,样品液中海参多糖浓度处于5-40mg/L时,标准曲线A=0.0087x+0.2057,R2=0.9914。该方法加样回收率为95.47%,其变异系数为1.41%(n=6),即本方法能用来测定海参多糖的含量。同时,用磺酸基间接测定海参多糖含量的方法验证了本方法测定海参多糖含量的准确性和可靠性。
3.通过比较长岛海参、薛家岛海参、张公岛三种原料及其煮汁,发现长岛海参的营养价值最高,同时在其煮汁的干物质中灰分和蛋白质含量较高,碳水化合物和脂类含量较少。对企业提供海参废液的基本营养成分进行了分析,发现水分含量最高,其次是灰分和蛋白质。测定微量元素中Na含量最多。另外,对干海参和海参加工废液中海参多糖含量的测定,确定了海参加工废液的应用价值。
4.通过实验得出海参多糖的最佳提取工艺条件为:
(1)超滤脱盐工艺:选用20KD的聚矾类中空纤维膜组件对海参废液进行超滤处理,最佳条件为超滤压力0.20MPa,25℃左右作为超滤温度,料液体积流量控制在0.04-0.05L/min。
(2)干制工艺:干燥方式选择喷雾干燥,控制其进出风温度为200-210/100-105℃,所得干粉含水量为3.3%,得率为5.3%。
(3)脱脂工艺:脱脂方式选择SFE脱脂,最佳条件为萃取压力35MPa,萃取温度50℃,CO2流量30kg/h,萃取时间3h。
(4)酶解工艺:选择中性蛋白酶为实验用酶,其用量为1.5%,酶解温度55℃,酶解时间8h。
(5)乙醇沉淀工艺:乙醇溶液浓度为80%,无水乙醇洗涤次数3次。
(6)最佳工艺提取海参多糖的得率为13.22%,海参多糖的纯度为37.83%。
5.粗多糖经活性炭吸附脱色、醋酸钾溶液去蛋白质、凝胶柱层析处理后,获得精致多糖。其性状为白色粉末,无臭、无味,有吸湿性,易溶于水,尤易溶于热水,不溶于高浓度的乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正丁醇等有机溶剂。不舍蛋白质和氨基酸,纯度为96.57%。
6.将海参多糖给大鼠灌胃连续30天,对其生长发育、进食量以及食物利用率均无影响,且对实验动物的红细胞、白细胞数量和各脏器组织状态也无明显影响。经急毒性试验,本实验所提取的海参多糖属于实际无毒物质。本实验所提取的海参多糖具有增强细胞免疫调节作用。