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背景过继免疫疗法(adoptive immunotherapy,AIT)是近年来迅速发展的恶性肿瘤治疗方法,嵌合抗原受体(chmeric antigen receptor,CAR)修饰免疫细胞尤其取得显著成果。细胞免疫疗法的关键基于安全高效的基因转导方法,将目的基因导入胞内。基因转导有多种方法,目前常用的有慢病毒、逆转录病毒及电穿孔等,但转染效率有限、生物安全性低限制了其发展。阳离子聚合物纳米材料生物相容性好、易于修饰、制备简单、稳定性好,而作为极具潜力的基因载体进入人们的视线。本研究利用新型纳米载体mPEG-P(Asp-AED-g-HFB)(PAEF)介导PiggyBac转座子系统修饰自然杀伤(Natural kill,NK)细胞,实现了较高的基因转导效率,为肿瘤细胞免疫治疗提供了实验依据。目的探索新型阳离子聚合物纳米载体PAEF和PiggyBac转座子介导嵌合抗原受体修饰NK细胞的基因转染方法,为肿瘤细胞免疫治疗制剂研发提供新策略。方法1.制备PAEF/DNA(转座子+转座酶)复合物,通过Nano-ZSE动态光散射系统(Malvern Instruments)测量PAEF/DNA复合物的粒径分布和表面电位。2.DNA凝胶电泳验证PAEF的包封率、释放性和稳定性,结合粒径电位选择进入细胞合适的N/P值。3.CCK-8细胞毒性实验分析不同N/P值条件下PAEF/DNA复合物的细胞毒性。4.荧光显微镜及流式细胞术检测细胞转染效率,评估PAEF基因转染载体的可行性。结果1.PAEF/DNA复合物粒径电位测定显示PAEF可包裹DNA形成粒径100~150nm的纳米复合物,有利于介导DNA进入细胞。2.DNA凝胶电泳显示,当PAEF/DNA复合物N/P值为20时,PAEF即可实现DNA的完全包裹;在还原剂二硫苏糖醇(dithiothreotol,DTT)存在的情况下,PAEF对DNA有良好的释放能力。3.CCK-8毒性实验表明N/P值为80时,PAEF/DNA复合物转染组的NK-92细胞存活率显著高于脂质体转染组([(72.5±3.9)%和(64.03±1.8)%,P<0.05]。4.PAEF/DNA复合物转染NK-92细胞48h,荧光显微镜下观察,N/P值80时,红色荧光蛋白(RFP)荧光多、荧光强度大;同样,在此N/P值条件下,流式细胞术显示达最高转染效率(83.4%)。传代培养10d,RFP仍能保持稳定的表达。结论1.本研究成功制备了新型阳离子聚合物纳米载体PAEF与DNA的复合物,经粒径及Zeta电位测量、DNA凝胶电泳包裹及释放实验均显示PAEF作为基因载体的可行性。2.PAEF/DNA复合物对NK-92细胞的细胞毒性明显较脂质体转染组低,说明生物相容性好,荧光显微镜及流式细胞术均显示转染效率较高,传代培养后荧光显微镜显示荧光仍有高表达。本研究建立了基于纳米载体的PiggyBac转座子介导的NK细胞基因转导方法,实现了较高的基因转导效率,为过继免疫治疗基因转导提供了试验依据。