酒精性肝病(ALD)是指由于酒精消耗诱导出现肝细胞损伤。目前,由于其发病率和死亡率逐年上升,且临床上尚无有效药物治疗的特点,越来越受到全世界的学者关注。肝细胞凋亡是参与酒精性肝损伤发病的一种重要机制。研究表明Sirtl可能是治疗ALD的一个重要靶点,其下游的p53对调控线粒体介导的凋亡通路至关重要。文献表明,牡荆苷有良好的抗凋亡活性。因此,基于以上理论,本课题提出"牡荆苷通过激活Sirtl,抑制p53表达及解除其乙酰化,从而抑制由酒精诱导的肝细胞凋亡,改善酒精性肝损伤"的科学假设,研究牡荆苷对酒精性肝损伤的保护作用及其机制,为酒精性肝损伤的治疗提供实验依据。目的:以不同浓度的乙醇诱导小鼠急性、亚急性酒精性肝损伤,初步评估牡荆苷拮抗小鼠急性、亚急性酒精性肝损伤的药效,考察牡荆苷干预后对小鼠酒精性损伤后的肝脏中Sirtl/p53介导的凋亡通路的影响,包括Sirtl、p53、Bcl-2、Bax、caspase3的mRNA和蛋白。然后以L02细胞系为模型,从体外层面进一步考察牡荆苷对L02细胞的保护作用及机制。方法:一、牡荆苷拮抗小鼠急性、亚急性酒精性肝损伤动物实验(一)牡荆苷预防小鼠急性酒精性肝损伤的实验雄性KM小鼠随机分为正常组、模型组、水飞蓟素组(80mg/kg)、牡荆苷低、中、高剂量组(20、40、80mg/kg)。按上述剂量单次给药,lh后,以4.8g/kgbw的乙醇诱导小鼠急性酒精性肝损伤。检测指标:肝脏系数、血清中AST、ALT、TC、TG含量。(二)牡荆苷治疗小鼠亚急性酒精性肝损伤的实验动物分组、给药剂量同上。第一周,除正常组外,上午每组给予30%的乙醇,按10ml/kg灌胃造模;下午给予不同浓度的牡荆苷和水飞蓟素治疗。第二周起,逐步上调乙醇造模浓度,第二、第三、第四周的造模浓度分别为为40%、50%、55%,至第四周造模给药结束。检测指标:肝脏系数、血清中AST、ALT、TC、TG、TP、TBIL、UA含量,肝脏病理切片观察。二、牡荆苷干预L02细胞酒精性损伤体外实验以一定浓度的乙醇诱导L02细胞损伤,同时给予不同浓度的牡荆苷和水飞蓟素,检测各组细胞的活性及上清AST含量,评估牡荆苷的体外药效。三、牡荆苷拮抗酒精性肝损伤作用机制研究在体外模型中,以流式细胞仪和荧光细胞成像仪检测各组细胞凋亡情况,进一步检测体内外模型中Sirt1/p53介导的线粒体凋亡通路相关基因和蛋白的表达。结果:一、牡荆苷拮抗小鼠急性酒精性肝损伤模型组小鼠肝脏系数、血清中AST、ALT、TC水平显著升高(P<0.05或P<0.01),通过单次给予牡荆苷后,肝脏系数、血清中AST、ALT、TC水平显著下降(P<0.05或P<0.01)。二、牡荆苷拮抗小鼠亚急性酒精性肝损伤模型组小鼠死亡率高,且肝脏系数、AST、AST/ALT、TC、TG、UA显著升高(P<0.05或P<0.01),给予牡荆苷治疗后,小鼠的肝脏系数、AST、AST/ALT、TC、TG、UA显著降低(P<0.05或P<0.01),并在一定程度上改善酒精性肝损伤的病理变化。三、牡荆苷对乙醇损伤LO2细胞的保护作用模型组细胞活性显著下降(P<0.01),AST含量显著上升(P<0.01),同时给予不同浓度的牡荆苷培养能恢复细胞活性(P<0.05或P<0.01),抑制AST的释放(P<0.01)。四、牡荆苷对Sirt1/p53介导的线粒体凋亡通路的影响在体内外模型中,牡荆苷干预后,Sirt1、Bcl-2表达显著升高(P<0.05或P<0.01),ac-p53、p53 及其比值、caspase3 显著降低(P<0.05 或P<0.01)。在体外模型中,牡荆苷能抑制细胞凋亡率(P<0.05或P<0.01)。结论:牡荆苷能有效拮抗酒精性肝损伤,其作用可能是通过激活Sirt1,调控p53的转录及乙酰化从而介导其下游的线粒体凋亡通路,抑制肝细胞凋亡实现的。