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骨质疏松症是危害人类健康的主要疾病之一,寻找切实有效的抗骨质疏松药物已成为当今医学领域的重大课题。传统中药里有许多活性物质具有抗骨质疏松作用,又因其具有副作用小等优点,在治疗骨质疏松中发挥着越来越重要的作用。但长期以来,临床医生只是凭经验使用中药来治疗疾病,中药成分复杂,即便是临床上经常使用的中药,也很少有人去研究它们的作用机制。目前中药现代化的实现和细胞培养技术的逐步发展,使得在更深的层次上研究中药的药理作用成为可能。本研究的目的就是建立一种基于细胞水平的抗骨质疏松中药药效学的评价方法。 首先,建立成骨细胞和破骨细胞的体外培养方法。通过酶消化法获得新生大鼠的成骨细胞。通过碱性磷酸酶(ALP)染色鉴定成骨细胞;用1,25(OH)2D3诱导骨髓单核细胞获得破骨细胞,并用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色进行鉴定。最后应用激光共聚焦显微技术,Bodipy FL Phallacidin荧光抗体和碘化丙啶(PI)进行标记后,观察两种细胞的细胞骨架F-actin。 然后本文采用传统血清药理学的方法制备含药血清,并对这一方法进行了改进。传统的方法是对成年大鼠直接灌胃给药,一段时间后取血制备含药血清。我们知道,骨质疏松症有很大一部分发生在绝经后的女性,雌激素的下降对骨质疏松症有着明显的作用。而本文在灌胃前将雌性SD大鼠进行去势处理,消除血清中雌激素的影响,从而更好的研究血清中的药物成分对细胞功能的影响。 再次,我们用体外培养的成骨细胞,建立了抗骨质疏松中药作用于骨形成的药效学评价方法。通过WST-1检测细胞代谢情况与增殖活力,用酶标仪检测成骨细胞分泌碱性磷酸酶和胰岛素样生长因子的功能。最后加入龟鹿复方不同剂量组10%含药血清,观察其对成骨细胞各项功能指标的影响。结果发现,高剂量组血清可明显促进成骨细胞增殖、ALP活性和IGF-1的分泌,说明龟鹿复方可以促进成骨细胞的骨形成。 最后,我们用体外培养的破骨细胞,建立抗骨质疏松中药作用于骨吸收的药效学评价方法。我们用扫描电镜(Scanning Microscope)技术观察破骨细胞形成的骨凹陷;同时检测TRAP(+)细胞数和破骨细胞TRAP活性。最后加入龟鹿复方含药血清进行干预,方法同成骨细胞。结果表明,中剂量组血清可明显抑制骨髓细胞向破骨细胞转化,抑制骨凹陷形成,降低细胞内TRAP的活性,减少TRAP(+)细胞数。说明龟鹿复方可以抑