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背景和目的:脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤。目前,恶性胶质瘤的治疗方式主要为手术切除瘤体联合术后放、化疗,但临床疗效不理想,致死致残率高。因此,探索恶性胶质瘤的全新治疗策略,具有重要的临床意义。重组免疫毒素是当前分子靶向治疗的热点,是治疗恶性胶质瘤全新策略之一。重组免疫毒素主要有两部分构成:有靶向作用的肿瘤特异性靶向分子和发挥杀伤作用的毒素蛋白。本研究选取在恶性胶质瘤细胞及组织中高表达,而在正常脑组织中低表达的分子EphA2受体作为肿瘤目标靶点,选取其特异性配体EphrinA1作为靶向分子,铜绿假单胞杆菌外毒素的活性片段PE38KDEL作为毒素蛋白,尝试构建重组免疫毒素EphrinA1-PE38KDEL。通过原核系统表达该重组免疫毒素,并观察其对恶性胶质瘤细胞的作用,为胶质瘤治疗的药物研发提供新的思路。方法:通过DNA克隆和突变技术,合成编码重组免疫毒素EphrinA1-PE38KDEL的基因序列。通过目的基因引物设计和质粒酶切、目的基因和质粒的连接、载体质粒转化克隆株等实验,构建重组免疫毒素载体质粒pET28a-EphrinA1-PE38KDEL。通过载体质粒的克隆、载体质粒转化表达菌株等实验,构建重组免疫毒素菌株BL21(DE3)-pET28a-EphrinA1-PE38KDEL。通过IPTG诱导、Ni-NTA亲和层析,咪唑梯度和pH梯度洗脱纯化等实验,原核表达重组免疫毒素EphrinA1-PE38KDEL。通过蛋白BCA法测定原核表达的重组免疫毒素EphrinA1-PE38KDEL的浓度。通过细胞摄取实验,观察重组免疫毒素EphrinA1-PE38KDEL能否特异性识别肿瘤靶点EphA2,能否进入肿瘤细胞。通过CCK-8增殖实验,观察重组免疫毒素EphrinA1-PE38KDEL对EphA2高表达的胶质瘤细胞U251、U87和EphA2低表达的正常人脑星形胶质细胞HEB的作用。结果:通过对载体质粒的双酶切后PCR和基因测序验证,成功构建了含重组免疫毒素 EphrinA1-PE38KDEL 基 因 片段 的重组质 粒pET28a-EphrinA1-PE38KDEL。通过SDS-PAGE电泳、蛋白质免疫印迹实验验证,经重组免疫毒素载体质粒pET28a-EphrinA1-PE38KDEL转化的大肠杆菌BL21(DE3)能够表达的重组免疫毒素EphrinA1-PE38KDEL。通过蛋白BCA法测定,经原核表达和纯化的可溶性重组免疫毒素EphrinA1-PE38KDEL的浓度为0.15μg/μ1。通过细胞摄取实验,观察到重组免疫毒素EphrinA1-PE38KDEL能够通过配体受体结合反应,进入胶质瘤细胞。通过CCK-8增殖实验,发现重组免疫毒素EphrinA1-PE38KDEL对人胶质瘤细胞U251和U87有靶向杀伤作用,且杀伤效果随剂量增加而增加,而对人正常脑星形胶质细胞HEB的杀伤作用不显著,不影响其正常生长。结论:经原核表达产生的重组免疫毒素EphrinA1-PE38KDEL可以靶向杀伤胶质瘤细胞,且不影响正常脑胶质细胞的生长。