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少孢节丛孢菌(Arthrobotrys oligospora)是研究真菌和线虫相互作用的模式生物，捕食线虫的武器是菌环和三维菌网。捕食器官的产生意味着少孢节丛孢菌从腐生生活转变到寄生生活方式。由于线虫表面以及肠道富含糖复合物结构，推测少孢节丛孢菌表达的凝聚素可能在捕食线虫过程中发挥重要作用。在前期研究中，发现了由该真菌AOL_s00076g540基因(缩写为g540)所编码的岩藻糖特异性凝集素AofleA可以在寡营养条件下分泌至胞外培养基中，并且可以与线虫肠道的糖复合物结合。基于此，推测AofleA在A.oligospora捕食线虫过程中可能发挥重要的功能，是一种潜在的少孢节丛孢菌的毒力因子。本文主要通过构建A.oligospora的AofleA基因(g540)敲除菌株和荧光蛋白原位标记菌株以阐明AofleA凝集素在A.oligospora捕食线虫过程中所发挥的作用；同时还探讨了重组表达的AofleA对岩藻糖的结合特异性及其在生物医学领域的潜在应用价值。主要研究内容和结果如下：
(1)通过CaCl2/PEG介导的原生质体转化方法，用潮霉素抗性基因对基因g540进行同源替换，在含有潮霉素的选择培养基上对转化子进行筛选,最终获得两株敲除突变株Δg540-19和Δg540-29。对敲除株Δg540和野生型菌株的菌丝生长速率、菌落形态、孢子生成数量、孢子萌发率、捕食器数量及捕食线虫能力进行比较，发现野生菌株和Δg540菌株在CMA、PDA、TYGA三种培养基上菌丝形态和菌落生长直径无明显差异；在TYGA培养基中生长后期，Δg540菌株的菌落直径比野生菌株略大，生长速度略快，但是无显著性差异。这表明g540基因的敲除对少孢节丛孢菌的生长没有显著影响。与野生型菌株比较，敲除菌株Δg540的产孢量下降了约47%，但其孢子萌发率要高于野生型菌株，这两个结果存在显著性差异。在接种后2h、4h和6h，敲除菌株Δg540的孢子萌发率分别增长了约7.3%、8.1%、6.7%。这表明g540基因的敲除对少孢节丛孢菌产孢量及孢子萌发率有一定的影响。在捕食器形成和捕食线虫活性方面，加入活线虫12h后，Δg540菌株产生的捕食器要稍少于野生型菌株；24h后，野生型菌株产捕食器数量明显多于Δg540菌株。与此相对应的，在12h和24h，Δg540菌株捕食线虫能力均小于野生型菌株；尤其是加入线虫后24h时，野生型菌株捕食线虫能力接近90%，而Δg540菌株捕食线虫能力未到50%，两种存在显著性差异。这表明g540基因的敲除对少孢节丛孢菌捕食器数量生成和捕食线虫能力具有显著影响。
(2)利用同源重组原理将g540基因的3’末端与红色荧光蛋白(mRFP)相融合，对g540基因进行原位荧光标记。扩增原位荧光标记质粒全长片段后，采用CaCl2/PEG介导的原生质体转化对目的基因进行同源重组，在含有潮霉素的选择培养基对转化子进行筛选,通过PCR及测序方法鉴定后，成功获得一株原位荧光标记菌株g540::mRFP。通过RT-PCR和Western blotting分析，发现g540::mRFP菌株的红色荧光蛋白有转录和表达。通过激光共聚焦扫描显微镜观察，发现Aoflea在孢子上大量表达，而在营养菌丝和捕食环上有少量表达。
(3)进一步，通过血凝抑制实验和糖芯片实验探讨了重组凝集素r-AofleA的糖结合特异性。血凝抑制实验表明r-AofleA能与岩藻糖特异性结合；糖芯片实验表明r-AofleA与所有类型的岩藻糖基化多糖和寡糖均有强结合性，包括Fucα1-2,Fucα1-3,Fucα1-4,以及Fucα1-6糖苷键。前沿亲和色谱实验表明r-AofleA与L-岩藻糖单糖之间的解离常数为15nM，这表明r-AofleA与岩藻糖之间的亲和力较强。
(4)最后，探讨了重组凝集素r-AofleA的潜在应用价值。通过将r-AofleA与线虫共同孵育，发现0.05-5mg/ml r-Aoflea与线虫孵育12-36h后，均能使线虫运动能力显著减弱。随着浓度增大，线虫运动能力减弱越显著。通过sandwich ELISA法，可以利用r-AofleA测定肝癌细胞样品中的AFP-L3%值，提示r-AofleA可能是一种潜在的检测岩藻糖基化程度的新型探针。划痕实验和侵袭实验表明r-AofleA能够显著抑制肺癌细胞A549的迁移，降低肺癌细胞A549的侵袭能力。
综上所述，本文得出如下初步结论：g540基因缺失在一定程度上抑制了少孢节从孢菌孢子的生成，但有利于其孢子萌发；同时，该基因缺失抑制了少孢节丛孢菌捕食器的生成，相应地显著降低了其捕食线虫的活性。AofleA在少孢节丛孢菌的孢子上高表达，而在其营养菌丝和3D捕食环上的表达较低。r-AofleA与所有岩藻糖基化的N-聚糖均有强结合性；能够减弱线虫尾部摆动运动能力；在肝癌临床样品中测定AFP-L3%具有潜在应用；能够抑制肺癌细胞A549的迁移和侵袭。这些研究结果为理解岩藻糖特异性凝集素AofleA的基因g540在少孢节从菌捕食器形成及其捕食线虫过程的作用提供了初步实验依据。
(1)通过CaCl2/PEG介导的原生质体转化方法，用潮霉素抗性基因对基因g540进行同源替换，在含有潮霉素的选择培养基上对转化子进行筛选,最终获得两株敲除突变株Δg540-19和Δg540-29。对敲除株Δg540和野生型菌株的菌丝生长速率、菌落形态、孢子生成数量、孢子萌发率、捕食器数量及捕食线虫能力进行比较，发现野生菌株和Δg540菌株在CMA、PDA、TYGA三种培养基上菌丝形态和菌落生长直径无明显差异；在TYGA培养基中生长后期，Δg540菌株的菌落直径比野生菌株略大，生长速度略快，但是无显著性差异。这表明g540基因的敲除对少孢节丛孢菌的生长没有显著影响。与野生型菌株比较，敲除菌株Δg540的产孢量下降了约47%，但其孢子萌发率要高于野生型菌株，这两个结果存在显著性差异。在接种后2h、4h和6h，敲除菌株Δg540的孢子萌发率分别增长了约7.3%、8.1%、6.7%。这表明g540基因的敲除对少孢节丛孢菌产孢量及孢子萌发率有一定的影响。在捕食器形成和捕食线虫活性方面，加入活线虫12h后，Δg540菌株产生的捕食器要稍少于野生型菌株；24h后，野生型菌株产捕食器数量明显多于Δg540菌株。与此相对应的，在12h和24h，Δg540菌株捕食线虫能力均小于野生型菌株；尤其是加入线虫后24h时，野生型菌株捕食线虫能力接近90%，而Δg540菌株捕食线虫能力未到50%，两种存在显著性差异。这表明g540基因的敲除对少孢节丛孢菌捕食器数量生成和捕食线虫能力具有显著影响。
(2)利用同源重组原理将g540基因的3’末端与红色荧光蛋白(mRFP)相融合，对g540基因进行原位荧光标记。扩增原位荧光标记质粒全长片段后，采用CaCl2/PEG介导的原生质体转化对目的基因进行同源重组，在含有潮霉素的选择培养基对转化子进行筛选,通过PCR及测序方法鉴定后，成功获得一株原位荧光标记菌株g540::mRFP。通过RT-PCR和Western blotting分析，发现g540::mRFP菌株的红色荧光蛋白有转录和表达。通过激光共聚焦扫描显微镜观察，发现Aoflea在孢子上大量表达，而在营养菌丝和捕食环上有少量表达。
(3)进一步，通过血凝抑制实验和糖芯片实验探讨了重组凝集素r-AofleA的糖结合特异性。血凝抑制实验表明r-AofleA能与岩藻糖特异性结合；糖芯片实验表明r-AofleA与所有类型的岩藻糖基化多糖和寡糖均有强结合性，包括Fucα1-2,Fucα1-3,Fucα1-4,以及Fucα1-6糖苷键。前沿亲和色谱实验表明r-AofleA与L-岩藻糖单糖之间的解离常数为15nM，这表明r-AofleA与岩藻糖之间的亲和力较强。
(4)最后，探讨了重组凝集素r-AofleA的潜在应用价值。通过将r-AofleA与线虫共同孵育，发现0.05-5mg/ml r-Aoflea与线虫孵育12-36h后，均能使线虫运动能力显著减弱。随着浓度增大，线虫运动能力减弱越显著。通过sandwich ELISA法，可以利用r-AofleA测定肝癌细胞样品中的AFP-L3%值，提示r-AofleA可能是一种潜在的检测岩藻糖基化程度的新型探针。划痕实验和侵袭实验表明r-AofleA能够显著抑制肺癌细胞A549的迁移，降低肺癌细胞A549的侵袭能力。
综上所述，本文得出如下初步结论：g540基因缺失在一定程度上抑制了少孢节从孢菌孢子的生成，但有利于其孢子萌发；同时，该基因缺失抑制了少孢节丛孢菌捕食器的生成，相应地显著降低了其捕食线虫的活性。AofleA在少孢节丛孢菌的孢子上高表达，而在其营养菌丝和3D捕食环上的表达较低。r-AofleA与所有岩藻糖基化的N-聚糖均有强结合性；能够减弱线虫尾部摆动运动能力；在肝癌临床样品中测定AFP-L3%具有潜在应用；能够抑制肺癌细胞A549的迁移和侵袭。这些研究结果为理解岩藻糖特异性凝集素AofleA的基因g540在少孢节从菌捕食器形成及其捕食线虫过程的作用提供了初步实验依据。