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研究背景与目的前列腺癌(Prostate cancer,PCa)是危害男性健康的恶性疾病,中国前列腺癌发病率呈上升趋势。目前常用于前列腺癌辅助诊断的指标为前列腺特异性抗体(Prostate-specific antigen,PSA),由于缺少特异性,基于PSA的前列腺癌监测和筛查被认为有过度诊治的风险。为了更准确地发现前列腺癌患者、减少不必要的前列腺活检,新型的循环肿瘤标志物亟待被发现,其中细胞外囊泡(Extracellularvesicles,EVs)的研究受到了广泛的关注。EVs是细胞释放的用于细胞间信息传递的膜性囊泡,EVs携带有亲代细胞特异性的核酸、蛋白质等物质,这些生物活性物质的含量变化可反映机体的生理病理状态,因此EVs有作为肿瘤生物标志物的潜力。EVs可从血清/血浆、尿液、脑脊液、唾液、乳汁等体液中分离得到,尿液作为一种可无创、大样本获得的体液标本,是泌尿系统疾病研究的理想标本类型。目前对尿液细胞外囊泡(Urinary extracellular vesicles,UEVs)的分离方法尚未统一,因此本研究利用新型的液压透析(Hydrostatic filtration dialysis,HFD)法分离健康人尿液中的EVs,与经典的超高速离心法(Ultracentrifugation,UC)对比分离UEVs的能力和微小RNA(microRNA,miRNA)的检出情况,随后在前列腺癌、前列腺增生和健康对照者的UEVs中验证已报道的与前列腺癌相关的miRNA,评价UEVs中候选miRNA的诊断效能。本研究主要分为以下两个部分:第一部分 液压透析法和超高速离心法UEVs分离效果的对比研究一、实验目的证实新型HFD法的UEVs分离能力,探索HFD分离的UEVs(HFD-UEVs)是否适用于后续的miRNA研究,并与经典的UC法进行比较。二、实验方法分别用HFD法和UC法分离健康志愿者的UEVs,通过透射电子显微镜、NanoSight纳米颗粒跟踪分析仪、Bradford蛋白定量和蛋白印迹技术对比UEVs的形态、粒径分布和特异标志物的表达,评估HFD和UC法的分离效率,采用Nnaodrop 2000、Agilent 2100生物分析仪和实时荧光定量聚合酶链反应(Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测 RNA总量、RNA组分和miRNA水平,并以配对t检验作统计分析。三、实验结果HFD法和UC法分离得到的UEVs有相似的形态和粒径分布范围,均表达EVs特异标志物,蛋白浓度及RNA总量差异无统计学意义,在RNA组分和miRNA水平方面也有一致结果。四、结论HFD法可简便地用于大样本UEVs的分离,其分离效率与经典的UC法相当,且HFD-UEVs可适用于后续的miRNA研究。第二部分UEVs前列腺癌相关miRNAs的检测及评价研究一、实验目的检测已报道的与前列腺癌相关的miRNA,筛选有作为诊断标志物潜力候选miRNA,对比血清和尿液EVs miRNA表达水平,分析EVs miRNA作为前列腺癌标志物的能力。二、实验方法从文献中筛选已报道的与前列腺癌相关的miRNA,分离前列腺癌、前列腺增生、健康对照者UEVs和配对血清EVs,逐步检测miRNA的表达水平,第一组检测标本由21例前列腺癌和14例前列腺增生患者组成,对差异有统计学意义的miRNA继续在第二组标本中检测,根据数据类型以t检验、one way ANOVA、Welch’s ANOVA统计miRNA表达水平的差异,以LSD、Games-Howell进行多重比较,绘制受试者工作曲线(Receiver operating characteristic curve,ROC)分析miRNA的诊断效能。三、实验结果初步检测结果显示 miR-107、miR-375、miR-21、miR-27a 和 miR-574 在各组中差异无统计学意义,选取miR-145、miR-1290、miR-141和miR-572在后续验证中检测。在UEVs中,前列腺癌患者miR-145和miR-1290水平显著高于前列腺增生患者和健康对照,在血清EVs中,miR-572、miR-1290、miR-141和miR-145在前列腺癌患者中均显著高于前列腺增生患者,且在血清EVs中的表达水平显著高于在UEVs中的表达水平。ROC曲线和曲线下面积(Areaunder ROC curve,AUC)提示血清 PSA 联合尿液 EVs miR-145(AUC:0.863)或血清PSA血清EVsmiR-145(AUC:0.895)均可提高血清PSA单独检测(AUC:0.805)的诊断效能,且UEVsmiR-145在Gleason Score≥8的患者中表达水平显著高于Gleason Score≤7的患者。四、结论miR-145在前列腺癌患者和前列腺增生患者的UEVs和血清EVs中均有差异表达,血清或尿液EVs中的miR-145联合血清PSA均可提高血清PSA的诊断效能,UEVs miR-145是前列腺癌的潜在诊断标志物。