研究背景:甲基苯丙胺(methamphetamine,METH)是一种新型合成毒品,因其外观形似冰,故俗称“冰毒”。METH滥用具有多器官功能损害作用,临床研究发现METH能在人体大脑组织浓聚并引发神经细胞变性和坏死。我们之前的研究表明METH具有明显的神经毒性,但是具体的作用机制还未明确。基质相互作用分子1(STIM1)存在于细胞内质网中,他的主要功能是感受内质网中钙离子并调节细胞内钙离子浓度,维持细胞内离子环境稳态。STIM1在调节细胞凋亡、迁移、增殖中起重要作用。在甲基苯丙胺中的作用下,STIM1能够诱导神经元多巴胺的释放,但具体作用机制改不清楚。目的:该篇研究主要讨论STIM1在METH导致神经细胞自噬和凋亡中的作用,进一步探讨METH神经毒性的作用机制。方法:第一章:构建METH体外(SH-SY5Y细胞和小鼠神经元原代培养细胞)中毒模型,通过Western Blot和免疫荧光检测STIM1的表达情况。利用小干扰技术敲除细胞中STIM1后检测自噬变化。利用GFP-mRFP-LC3腺病毒跟踪METH作用下自噬流的流通情况。第二章:沉默STIM1/Orai1蛋白后检测METH诱导的内质网应激和线粒体凋亡的变化。利用钙离子荧光探针检测敲除STIM1和Orai1后细胞内钙离子浓度变化。沉默Orai1后检测自噬的变化,从而探讨自噬和凋亡的关系。第三章:构建不同METH小鼠体内中毒模型,通过Western Blot检测STIM1的表达情况,小鼠海马组织立体定位注射干扰STIM1的慢病毒后,在体内验证STIM1参与METH诱导的神经组织自噬和凋亡。结果:第一章1.细胞模型中STIM1的表达随着METH暴露浓度和时间的增加而增加。2.在体外抑制STIM1的表达后p-AKT、p-mTOR表达量增高,Beclin1、LC3Ⅱ的表达量明显降低,表明STIM1参与了 METH诱导的自噬。第二章1.抑制STIM1蛋白表达后线粒体功能恢复、凋亡标记蛋白明显降低。2.METH作用下STIM1寡聚化诱导内质网应激和CHOP蛋白表达。抑制STIM1蛋白能逆转METH诱导的内质网应激和CHOP的表达。3.STIM1寡聚化使内质网向细胞膜迁移激活Orai1导致细胞内钙离子紊乱,引起内质网应激和线粒体凋亡,敲除Orai1后内质网应激和线粒体凋亡通路明显被抑制,但敲除Orai1后自噬变化不明显。第三章1.不同METH小鼠中毒模型中海马和纹状体STIM1的表达有不同程度的增加。2.体内模型证明STIM1通过Orai1参与METH导致的小鼠海马组织内质网应激、线粒体凋亡和细胞自噬。结论:STIM1在METH诱导神经毒性中起重要作用,METH暴露导致STIM1寡聚化,内质网向细胞膜迁移并打开Orai1通道导致细胞外的钙离子内流,进而引起细胞内钙离子紊乱和内质网应激,触发经典的线粒体凋亡。同时,STIM1也参与了 METH导致的自噬。