丹酚酸B的提取分离及其对血管舒张作用的研究

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丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)是我国应用较早的中药材,其药效广泛。《中国药典》(2005)中记载丹参有“活血祛瘀、通经止痛、清心除烦”等功效,为许多方剂和现代中药的主要原料,临床上应用广泛。现代药学及药理学研究表明,丹参中的水溶性多酚酸类物质是其主要活性部位,其药用功效不断被证明。丹酚酸B是丹参中含量最高的水溶性成分,因其独特的药理活性,成为近年来的研究热点。但丹酚酸B稳定性较差,给高纯度丹酚酸B的获得增加了难度,也给丹酚酸B的临床应用带来了隐患。  本文以丹参为原料,采用HPLC和TCL分析检测方法,以丹酚酸B的含量、得率为检测指标,在研究丹酚酸B稳定性的基础上,对从丹参中获得高纯度丹酚酸B的工艺条件进行了初步探索与优化;在分离获得高纯度丹酚酸B的基础上,采用离体动脉灌流方法,以大鼠离体胸主动脉血管环为模型,血管环张力大小为实验指标,研究丹酚酸B对大鼠胸主动脉的作用及其机制,为丹酚酸B药物的开发及在心脑血管疾病治疗方面提供了理论依据。  主要研究结果如下:  (1)通过对丹酚酸B的分析检测方法的研究,确定了丹酚酸B的HPLC及TCL的测定方法。HPLC检测方法为:色谱柱,XB-C18(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相,甲醇:0.02%磷酸(50:50);检测波长,284 nm;柱温,30℃;流速,0.7 mL/min,经过方法学考察,验证此方法稳定可行,重复性好,并测定了丹酚酸 B标准曲线,得回归方程Y=29479X+790.01,R2=0.9995,表明丹酚酸B在0.042 mg/mL~0.840 mg/mL范围内与所得峰面积线性关系良好;TCL检测方法为,正己烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(4:5:1:1),能够实现丹酚酸B和其它物质分离。  (2)以自制丹酚酸B为原料,通过单因素实验法,对丹酚酸B水溶液的稳定性进了研究,分别考察了时间、温度、pH值、丹酚酸B浓度对水溶液稳定的影响,得出丹酚酸B在60℃,加热时间>10 h时,丹酚酸B含量迅速降低;丹酚酸B水溶液在0℃~60℃内丹酚酸B含量相对稳定,当温度超过60℃时,含量显著下降;丹酚酸B水溶液在pH=2左右时最为稳定,当pH>4时,稳定性逐渐变差,pH达到10后,丹酚酸B几乎完全降解;丹酚酸B水溶液在高浓度时稳定性高于较低浓度。  (3)在以上研究基础上,对从丹参药材中获得高纯度丹酚酸B的工艺进行了研究。首先以丹酚酸B得率为检测指标,选定提取方法为以未粉丹参药材原料,8 BV pH=2酸水(浸泡12 h)渗漉提取,流速为4 mL/min;然后用静态实验与动态实验相结合的方法,以丹酚酸B的含量、吸附量和解吸量为指标,对DM130、AB-8、D101、XAD-8及LX-68G五种大孔树脂进行选择,最终选定AB-8为丹酚酸B分离树脂,吸附量可达41.36 mg/g,且最先到达吸附平衡,解吸率为98.38%,并进一步对丹酚酸B AB-8分离工艺进行研究,确定上样后,先用3 BV pH=2酸水洗脱杂质,再用6 BV20%乙醇、5 BV40%乙醇进行梯度洗脱,既得纯度为83.5%的丹酚酸B;为保证丹酚酸B固体良好的性状,进行乙酸乙酯萃取,条件为40%乙醇洗脱液浓缩至丹酚酸B含量约15 mg/mL,加等体积的乙酸乙酯萃取3次,减压浓缩,冷冻干燥,既得丹酚酸B粗品;最后以丹酚酸B含量为检测指标,对丹酚酸B进行硅胶柱纯化,条件为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(4:5:1:1)为洗脱溶剂,上样量与柱体积之比(mg/ml)为(2.0~2.5):5,洗脱流速为1 mL/min(每500 mL柱体积),经硅胶柱纯化,得含量>98%的丹酚酸B,回收率为51.52%。  (4)以大鼠离体胸主动脉血管环为模型,血管环张力大小为指标,从丹酚酸B对血管环基础张力、NA,KCl,L-NAME,MB,IM预处理血管环及细胞内钙外流、外钙内流几方面的影响,研究丹酚酸 B对血管环的作用及机制,结果表明,丹酚酸B具有扩张血管的作用,且部分依赖于内皮细胞,主要作用于内皮依赖性的NO-cGMP信号通路,细胞内钙离子的释放,并通过抑制ROC来抑制细胞外钙离子内流,通过多信号通路共同作用产生血管舒张作用。
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