论文部分内容阅读
高脂血症是由机体内血脂异常所引起的慢性代谢性疾病,能够导致血栓、冠心病等多种心血管疾病的发生,严重危害人类的健康。目前高脂血症的主要治疗方法是使用化学合成类药物,但长期服用降血脂药物会导致横纹肌溶解、肝脏毒性和新发糖尿病等多种副作用。因此,开发出副作用少且成本低的高血脂症治疗剂是十分有必要的。食药用菌被证实具有多种生物活性,并在维持健康和预防疾病方面有着悠久的历史。灰树花(Grifola frondosa,GF)主要分布在亚洲、欧洲和北美东部,由于其抗高血脂、抗糖尿病、抗高血压、抗炎、抗氧化以及免疫调节等方面的作用,在中国和其他亚洲国家被广泛使用。目前对GF的研究主要集中在菌株液体发酵、营养成分分析、多糖分离纯化和生物活性这几个方面,然而,还没有关于基于炎症的GF及其纯化多糖的脂代谢调控作用的研究。首先,本研究分析了GF中的多种主要活性成分。结果表明,GF中含有44.30%总糖、22.50%还原糖、15.90%总蛋白、10.80%粗纤维、5.60%总灰分、4.80%粗脂肪、0.90%总皂苷、0.76%甘露醇、0.30%总酚、0.25%总三萜、0.21%总甾醇、0.21%总黄酮和0.03%总生物碱。证明GF是一种高碳水化合物和蛋白质含量、低脂肪含量的真菌。在检测到的11种维生素中,维生素B3、维生素B1和维生素C的含量最高。检测到钾、镁、铁、钙、钠、锌、铜、锰和硒等9种矿物质,其中钾元素(2.2×10~4 mg/kg)含量最高。此外,重金属铅、镉和汞的浓度均低于国家标准(GB 2762-2017)中规定的食品中污染物限量,证明了GF的食用安全性。第二,采用高脂饮食喂养(HFD)小鼠模型研究GF对脂质代谢的影响。GF能够显著控制HFD小鼠的体重增长和血糖值,恢复相关脏器指数。GF能够显著调节HFD小鼠脂代谢相关因子和胰岛素抵抗相关因子的水平,恢复HFD小鼠脂肪组织和胰腺组织形态,有效改善由HFD所引起的小鼠脂代谢异常和胰岛素抵抗。GF还能够有效缓解肝脏脂肪变性,调节HFD小鼠肝脏中谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)和相关炎症因子的水平,具有良好的肝脏保护功能。肠道菌群分析结果表明,GF能够显著降低HFD小鼠肠道中链球菌、葡萄球菌和分枝杆菌等20个属的相对丰度,显著升高瘤胃球菌等6个属的相对丰度。差异Meta Cyc代谢通路物种组成分析发现GF能够调节与炎症相关的血红素生物合成途径,这可能与其脂代谢调控作用有关。脂质组学分析结果表明,GF能够显著调节HFD小鼠中包括神经酰胺(Cer)在内的11种差异代谢物的水平。Cer是一种与炎症和胰岛素抵抗相关的代谢物。结合酶联免疫吸附测定(ELISA)和western blot结果进一步发现,GF能够降低HFD小鼠血清中Cer水平,同时抑制Cer介导toll样受体4(TLR4)/核因子κB(NF-κB)通路和含NLR家族Pyrin域蛋白3(NLRP3)通路。通过单因素试验获得灰树花粗多糖(GFP)的最佳水提工艺为:提取温度80°C,提取时间120 min,料液比1:40(g/m L)。提取两次,将提取液合并,经浓缩、Sevag法除蛋白、80%乙醇沉淀、透析、冻干后获得GFP,得率为4.4%。使用二乙氨乙基阴离子交换柱对GFP进行纯化,获得GFP2,得率为19.4%(以GFP计)。使用Ez Load 26/60 Chromdex 200凝胶柱对GFP2进行纯化,最终获得GFPA,得率为7.6%(以GFP2计)。随后对GFPA的结构和理化性质进行分析。根据紫外光谱结果,在260 nm和280 nm处没有观察到吸收峰,表明GFPA中不存在核酸和蛋白质成分。GFPA的数均分子量为4188.9 k Da,重均分子量为5570.2k Da,多分散指数为1.33,具有相对均一的分子量。GFPA的分子构型呈现出不规则的卷曲状,表明其存在分支。GFPA由葡萄糖、半乳糖和岩藻糖组成,摩尔比为99.73:0.17:0.10。傅立叶变换红外光谱显示GFPA包含糖类的特征峰,如O-H的伸缩振动、C-H伸缩振动、C=O伸缩振动、C-O伸缩振动和O-H变角振动等。GFPA最主要的糖苷键残基为β-D-Glcp-(1→、→4)-α-D-Glcp-(1→和→4,6)-β-D-Glcp-(1→。采用核磁共振法对GFPA进行结构鉴定,明确其糖苷键组成和主要连接方式。通过扫描电镜观察到GFPA表面呈现出不规则的分支网络结构。最后,利用HFD小鼠模型进一步研究基于炎症的GFPA的脂代谢调控作用。结果表明,GFPA给药能够有效抑制HFD小鼠体重增长和血糖浓度。GFPA能够恢复HFD小鼠血清和肝脏中甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇以及高密度脂蛋白胆固醇水平,改善高脂血症。GFPA能够有效降低脂肪细胞大小并改善脂肪组织的炎性浸润。GFPA还降低了HFD小鼠血清和肝脏中AST和ALT的浓度,改善肝脏中脂肪堆积和炎症浸润的现象,从而减轻了肝脏脂肪变性。进一步研究发现GFPA能够通过抑制HFD小鼠中Cer水平来调节脂质代谢。ELISA结果表明,GFPA降低HFD小鼠血清和肝脏中Cer、TLR4、髓样分化因子、肿瘤坏死因子受体相关分子6、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素(IL)-6和IL-1β的水平。Western blot结果进一步证实GFPA可以抑制TLR4/NF-κB通路。以上结果表明:(1)GF中含有多种营养成分,碳水化合物和蛋白含量较高,脂肪含量较低,其中总糖(44.30%)是含量最高的成分;(2)在HFD小鼠中,GF能够通过抑制Cer介导的慢性炎症反应和胰岛素抵抗发挥脂代谢调控作用;(3)从GF中纯化出一种具有支链结构的大分子多糖GFPA,对其进行结构表征,发现其主要糖苷键为β-D-Glcp-(1→、→4)-α-D-Glcp-(1→和→4,6)-β-D-Glcp-(1→;(4)在HFD小鼠中,GFPA通过抑制Cer介导的TLR4/NF-κB炎症通路发挥脂代谢调控作用。本研究将为GF及其多糖作为降血脂药物的开发和应用提供实验依据。