猪和兔是重要的农业经济动物和生物医药用动物,对猪和兔进行高效精确的基因编辑并获得基因修饰猪和兔模型具有非常重要的意义。在农业育种方面,基因修饰猪和兔模型可以成功提高动物个体生长速度,改良生产和抗病抗逆性状等,大大加速优良新品种的培育进程。在生物医药领域方面,由于物种差异性的存在,仅利用小鼠,大鼠等小型啮齿类动物模型几乎不能完全模拟人类的各种复杂的生命动态过程,例如模拟人类早期胚胎发育,特定组织器官生长发育过程以及人类疾病发生发展等。猪和兔是一种理想的大动物模型,相较于灵长类大动物模型而言,猪和兔繁殖周期更短,产仔数量更多,伦理道德限制更少;与啮齿类动物相比猪和兔在解剖及生理、生化特征以及营养代谢和免疫系统等方面与人更为接近。很多研究无法直接在人体中进行,可以构建基因修饰猪和兔模型进行更广泛的实验和评估,此外,基因修饰猪和兔模型对于特定基因的功能研究,在组织或器官生长发育过程的作用等生命动态过程研究方面具有重要的研究价值。哈佛大学教授贺熹《Cell》文章证实,Tiki1在爪蟾头部生成和发育的诱导过程中起着决定性的作用,而Tiki1基因在哺乳动物系统中发挥的功能和作用机制尚未有报道。Tiki1基因在小鼠等啮齿类动物中缺失,因而无法利用啮齿类动物模型研究Tiki1基因在哺乳动物发育过程中的作用。本实验室对12~15天处于原条期到神经沟阶段的猪胚胎进行了全胚胎原位杂交,实验结果也显示Tiki1基因在胚胎前端边缘处表达,但在猪等哺乳动物的胚胎发育过程中,Tiki1是否像在爪蟾上一样,对头部的诱导起着关键性的决定作用,需要加以验证。基因敲除是研究基因功能的主要途径之一,传统的基因敲除技术是同源重组,但对于猪这种既没有成功建立能够生殖系遗传的胚胎干细胞或诱导多能干细胞,克隆效率又较低的物种来说,利用同源重组结合体细胞克隆技术获得期望的基因打靶动物是极其困难的。本实验室曾尝试利用打靶效率极低的同源重组技术获得Tiki1基因打靶猪模型但未能成功。近几年兴起的核酸酶基因编辑技术,包括ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9等基因编辑工具,由于其效率高,为猪和家兔等这样一些克隆效率低下、又缺少能生殖系遗传的全能性胚胎干细胞物种的基因修饰开辟了新渠道,极大地推动了基因编辑猪和兔模型的研究进展。其中ZFN制备复杂、打靶效率低、成本高昂限制了其在基因修饰猪和兔研究中的应用。为了探究Tiki基因在不同物种间的功能差别,本研究先后利用TALEN与CRISPR/Cas9技术构建了Tiki基因敲除猪和兔。本研究首先针对猪内源性基因Tiki1基因外显子4设计了2对TALENs质粒,并在猪孤雌胚胎水平上进行了TALENs质粒的体外活性检测,比较了我们设计的TALENs质粒注射不同浓度时打靶效率及对胚胎发育的影响。结果表明:注射浓度升高,打靶效率也相应提高,TALENs的注射浓度对体外胚胎发育的影响不明显。利用我们设计的在胚胎水平上验证有效的TALENs质粒转染猪胎儿成纤维细胞,筛选获得86个细胞克隆,经测序鉴定其中6个为阳性细胞克隆,之后利用体细胞核移植技术成功构建了4头Tiki1单等位基因打靶猪模型。本研究利用X线计算机断层扫描(CT)和核磁共振成像(MRI)等影像学技术结合病理组织切片分析及临床生理生化分析等对Tiki1单等位基因敲除猪模型进行了表型分析,未发现Tiki1单等位基因敲除猪模型具有与爪蟾上类似的表型。考虑到物种差异及兔成本低实验周期短,本研究利用TALEN技术成功构建了Tiki1单等位基因敲除兔模型,结果也未发现Tiki1单等位基因敲除兔模型具有与爪蟾上类似的表型。由于TALEN的打靶效率尚不够高,本研究利用TALEN技术获得的猪和兔全是Tiki1单等位基因敲除动物模型。为了一步获得Tiki1双等位基因敲除猪模型,本研究利用CRISPR/Cas9技术设计构建打靶质粒转染猪胎儿成纤维细胞,经细胞筛选、PCR扩增及测序共鉴定了8个阳性单细胞克隆株,随后本研究利用体细胞核移植技术构建了720个重组胚胎,分别植入3头代孕母猪,经测序鉴定成功获得了12头Tiki1双等位基因敲除猪模型。后续本研究利用动物步态足迹实验和跑步机加速和恒速跑步等行为学实验对Tiki1双等位基因敲除猪模型进行了行为学表型分析,结果表明未发现Tiki1双等位基因敲除猪模型具有与爪蟾上类似的表型。考虑到Tiki基因包括Tiki1和Tiki2,二者之间可能存在协同或代偿机制,由于兔实验成本低周期短,而与兔相比猪实验成本高周期长,本研究优先选择兔为研究对象,利用CRISR/Cas9技术一步直接获得了Tiki1和Tiki2同时双等位基因敲除兔模型,结果也未发现Tiki1和Tiki2同时双等位基因敲除兔模型具有与爪蟾上类似的表型。综上所述,本研究通过上述所得各种基因型的Tiki基因敲除猪和兔模型均未发现具有与爪蟾上类似的表型,并且相关模型猪和兔均可以健康存活并能不断繁殖传代。本研究证实了Tiki基因在爪蟾与哺乳动物如猪和兔等不同物种间功能存在差异,Tiki基因在猪和兔等哺乳动物上确实对其早期胚胎的头部发育乃至个体的生长、发育和繁殖不是一个至关重要的基因,成功地澄清了Tiki基因与猪和家兔等哺乳动物早期胚胎头部发育的关系不同于爪蟾。