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番茄细菌性斑点病(tomato bacterial speck)是一种常见的番茄病害,该病传染性较强、发病较快,不易防治,影响了果实品质,降低番茄的产量。诱发该病害的病原微生物为丁香假单胞杆菌番茄致病变种(Pseudomonas syringae pv.tomato,Pst)。在抗病番茄体内存在Pto基因,编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,可以特异识别丁香假单胞杆菌释放的效应蛋白,由此激活下游防御反应。Pto作为番茄抗病免疫机制中的一个枢纽蛋白,其下游途径包括三个与其相互作用的转录因子,分别命名为Pti4、Pti5和Pti6,对这些Pto互作蛋白功能的研究利用了模式植物拟南芥,但它们在番茄中的功能表型仍需较为系统的分析和比较。本文通过获得稳定遗传的纯合过表达遗传转化番茄株系对其功能进行研究。q RT-PCR结果表明,Pti4、Pti5、Pti6过表达番茄植株中病程相关基因PR1、PR2、PR5的表达水平显著升高;接种病原菌Pst DC3000后,植株叶片病斑与菌落计数均明显低于野生型,抗病性提高。由于该类转录因子蛋白序列与植物特有的乙烯反应元件结合蛋白(ethylene response element-binding protein,EREBP)家族同源,本文也探究了Pti4、Pti5、Pti6在果实成熟方面可能的影响。田间观察以及催熟实验表明,Pti4、Pti5、Pti6过表达番茄果实转色快、成熟早,植株对乙烯的响应增强。但对开花时间以及结实率并没有改变,对果实重量、大小、果形、硬度、可溶性固形物含量、糖酸比等果实性状也无明显不利影响。此外,Pti4/5/6过表达番茄果实腐败速度减缓。进一步对果实中相关酶的活性测定结果显示,Pti4、Pti5、Pti6上调后番茄果实中苯丙氨酸解氨酶、过氧化氢酶、过氧化物酶活性升高,这些酶在合成植物抗病物质及清除细胞内活性氧等方面有重要作用;与之相应果实中反映细胞膜损伤程度的丙二醛含量则降低。另一方面,cell-free蛋白稳定性、体内泛素化实验表明,Pti4、Pti5、Pti6蛋白在植物体内受泛素-蛋白酶体系统介导降解。表明这些转录因子在调控番茄抗病反应、乙烯应答的同时,自身也受到调控。因此,本工作对番茄转录因子Pti4/5/6的功能分析表明,它们在抗病性、果实成熟中发挥调控作用。Pti4、Pti5、Pti6基因的上调可以提高番茄植株的抗病能力,促进果实的成熟,而对果实产量和品质特性未有明显不利影响,且可能对延长番茄货架期有一定作用,具有遗传改良应用潜力。此外,Pti4/5/6基因的功能意味着基础防御、激素应答,以及转录后调控之间的交叉联系,本研究进一步通过构建番茄叶片c DNA酵母双杂交文库,筛选Pti互作蛋白,为后续深入研究其分子机制奠定了基础。