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肺癌是目前世界范围内最常见的恶性肿瘤,对人类生命健康造成严重威胁,是世界范围内癌症相关死亡的主要原因。肺腺癌（lung adenocarcinoma,LAC）是最常见的病理亚型,约占所有肺癌相关死亡率的40%。尽管不断有新的治疗策略用于临床,但LAC的5年生存率仅为18%。晚期LAC预后不良的原因包括低诊断率、出现转移和缺乏有效的治疗靶点等。因此,寻找新的特异性和敏感性生物标志物和治疗靶点对LAC患者的有效治疗具有重要价值。环状核糖核酸（Circular ribonucleic acid,circ RNA）是一类新的内源性剪接RNA,20世纪70年代,在病毒中首次被发现,由于技术水平限制,当时普遍认为circ RNA是pre-m RNA剪接过程中的附加产物,不具有生物学功能。目前已发现,circ RNA可调控癌症进展。由于其共价闭合环结构没有5′-3′多聚腺苷酸化末端,具有抵抗外切酶活性的能力,并保持高度稳定,这表明它们有潜力作为癌症生物标志物和治疗靶点。越来越多的证据表明,circ RNA在调节LAC发生发展过程中发挥着重要作用,拥有很好的稳定性、组织特异性和物种保守性,有望为LAC的诊断、治疗及预后分析提供新手段。本研究通过分析GEO（gene expression omnibus）数据库发现,与配对的相邻非癌组织相比,有三种circ RNA在LAC组织中高表达。回顾性临床研究显示,这三种circ RNA表达水平越高,LAC患者预后越差。为了揭示这些circ RNA潜在的生物学机制,我们对其靶向微小核糖核酸（Micro RNA,mi RNA）和可能影响的下游信使核糖核酸（Messenger RNA,m RNA）进行筛选,构建circ RNA-mi RNA-m RNA调控网络。随后建立了一个蛋白质与蛋白质相互作用（Protein protein interaction,PPI）网络,最终确定了六个枢纽基因。使用基因表达谱交互分析（GEPIA）数据库进行的回顾性研究显示,每个枢纽基因表达水平高与LAC患者较差的总生存期相关。这些发现揭示了一些新的circ RNA可能在LAC病理生理学中发挥重要作用。此外,通过对circ RNA-mi RNA-m RNA网络调控LAC进展的分子机制研究,揭示hsa＿circ＿0006220、hsa＿circ＿0072088和hsa＿circ＿0001666有可能成为LAC的生物标志物和治疗靶点。第一部分肺腺癌及癌旁组织中差异表达环状RNA分析研究目的:通过基因数据库数据筛选LAC患者癌及癌旁组织中差异表达circ RNA,结合临床数据分析,探究潜在circ RNA在LAC发生及发展中的作用。方法:1.通过limma package对GEO中数据集GSE101586进行分析,获得LAC组织与其对应癌旁组织中差异表达的circ RNA谱图。2.选择潜在circ RNA,利用逆转录-定量PCR（RT-q PCR）验证这些circ RNA在LAC组织中表达情况。3.通过Sanger测序法鉴定潜在circ RNA的PCR产物序列,RNase R处理三种circ RNA,验证潜在circ RNA的环化性质。回顾性分析临床资料揭示这些circ RNA在LAC发生及发展中作用。结果:1.用limma package对GEO中GSE101586数据集进行分析,与癌旁组织相比,LAC组织中共有47个上调的circ RNA和21个下调的circ RNA。在设定标准后,筛选出在LAC组织中显著上调的四种circ RNA hsa＿circ＿0043278,hsa＿circ＿0006220,hsa＿circ＿0072088,hsa＿circ＿0001666。2.经RT-q PCR证实circ RNA hsa＿circ＿0006220、hsa＿circ＿0072088、hsa＿circ＿0001666在LAC组织中表达上调。3.经过基因测序验证了三种circ RNA的剪切环化位点序列。4.这三种circ RNA都对RNase R具有抗性,而对应的线性形式在RNase R处理后的水平显著降低。验证了三种circ RNA的环化性质。5.三种circ RNA表达水平高与LAC患者预后差相关。小结:hsa＿circ＿0006220、hsa＿circ＿0072088和hsa＿circ＿0001666在LAC中表达较癌旁组织高且表达稳定。三种circ RNA的表达水平越高,LAC患者预后越差。第二部分不同环状RNA对肺腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的分析研究目的:通过体外实验,观察hsa＿circ＿0006220、hsa＿circ＿0072088和hsa＿circ＿0001666对LAC细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法:1.LAC细胞培养。2.si RNA转染LAC细胞。3.细胞计数试剂盒-8（CCK-8）（MCE）检测LAC细胞增殖。4.Transwell和Matrigel实验检测LAC细胞迁移和侵袭。结果:1.CCK-8实验检测显示si-hsa＿circ＿0006220、si-hsa＿circ＿0072088和si-hsa＿circ＿0001666转染后LAC细胞增殖能力减低。（P＜0.05）2.Transwell和Matrigel实验检测结果显示si-hsa＿circ＿0006220、si-hsa＿circ＿0072088和si-hsa＿circ＿0001666转染后LAC细胞迁移和侵袭能力减低。（P＜0.05）小结:si-hsa＿circ＿0006220、si-hsa＿circ＿0072088和si-hsa＿circ＿0001666介导的circ RNA敲除可以抑制LAC细胞增殖、迁移和侵袭。三种circ RNA在LAC细胞中可能具有致癌作用。第三部分环状RNA调控肺腺癌进展的生物学机制研究目的:研究circ RNA潜在的生物学作用,揭示circ RNA在LAC发生发展中的分子调控机制。方法:1.使用Circ Interactome数据库筛选circ RNA潜在靶mi RNA。利用mi RWalk软件筛选靶mi RNA可能影响的下游m RNA,从TCGA数据库获得LAC中表达上调的m RNA。2.对筛选重叠的m RNA分析,利用Cyto Hubba plugin in Cytoscape筛选枢纽基因,构建circ RNA-mi RNA-hubgene亚网络。3.建立蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络,使用基因表达谱交互分析（GEPIA）数据库研究每个枢纽基因表达水平与LAC患者总生存期关系。4.LAC组织制备病理切片,对60例LAC标本进行免疫组化来分析验证研究结果。结果:1.使用Circ Interactome数据库以评分百分位≥98为标准,筛选出circ RNA潜在靶mi RNA（mi R-520f、mi R-1261、mi R-1270、mi R-620、mi R-188-3p、mi R-516b、mi R-940和mi R-661）,预测出mi RNA的结合位点。2.从mi RWalk数据库中获得上述8个mi RNAs的7829个靶基因。并从TCGA中获得了795个LAC上调基因。分析7829个靶基因和795个上调基因重叠部分,发现232个可能在LAC中发挥关键作用的靶基因。3.构建circ RNA-mi RNA-m RNA网络,构建PPI网络,Cytoscape中的Cyto Hubba插件分析PPI网络,确定了6个枢纽基因:KIF2C,KIF18B,MELK,BIRC5,PLK1和CKAP2L。4.GEPIA数据库分析显示这6个枢纽基因在LAC组织中的表达水平明显高于正常组织。每个枢纽基因高水平表达与患者较差的总生存率相关,所有这6个枢纽基因都显示出可能在LAC中发挥重要作用。5.Cytoscape 3.7.1构建circ RNA-mi RNA-枢纽基因调控网络,推测出三种circ RNA在LAC进展中的分子调控机制,hsa＿circ＿0006220/hsamir-520f/KIF2C,hsa＿circ＿＿0001666/hsa-mir-940/KIF18B,hsa＿circ＿＿0001666/hsa-mir-940/CKAP2L,hsa＿circ＿＿0001666/hsa-mir-661/CKAP2L,hsa＿circ＿＿0001666/hsa-mir-188-3p/PLK1,hsa＿circ＿＿0072088/hsa-mi R-1270/MELK,hsa＿circ＿＿0072088-hsa-mi R-1261-BIRC5。6.LAC组织免疫组化显示,KIF2C、KIF18B、MELK、BIRC5、PLK1和CKAP2L的高水平表达与LAC患者生存期较差相关,hsa＿circ＿0006220的表达与KIF2C的表达呈正相关,hsa＿circ＿＿0001666的表达与KIF18B、PLK1和的CKAP2L表达呈正相关。hsa＿circ＿＿0072088的表达与MELK和BIRC5的表达呈正相关。实验结果对hsa＿circ＿0006220、hsa＿circ＿0072088、hsa＿circ＿000166可能作为mi RNA海绵,调控mi RNA发挥竞争性抑制其下游靶向m RNA表达的调控机制予以了验证。小结:hsa＿circ＿0006220、hsa＿circ＿0072088和hsa＿circ＿0001666可能通过调控KIF2C,KIF18B,MELK,BIRC5,PLK1和CKAP2L的表达而发挥致癌作用。结论:1.三种环状RNA hsa＿circ＿0006220、hsa＿circ＿0072088、hsa＿circ＿0001666在LAC组织中高表达,且与患者的不良预后相关,可作为LAC潜在的生物标志物和治疗靶点。2.三种circ RNA促进LAC的增殖、侵袭和迁移。3.三种circ RNA可作为mi RNA的分子海绵,调控mi RNA下游的关键靶m RNA,对肺腺癌细胞的功能发挥调控作用。