脑卒中目前在全球范围内,已成为被人们广泛关注的健康难题,包括缺血性卒中和出血性卒中。缺血性卒中是脑卒中的主要临床类型,约占60%-80%。氧化应激反应引起的过氧化损伤是缺血性脑损伤发生的重要机制,在脑组织缺血再灌注损伤的病理过程中,氧化应激产生大量活性氧,可导致DNA、蛋白质和脂质等的损伤,并可直接作用于生物膜上的不饱和脂肪酸,损伤生物膜。过量的活性氧会破坏细胞的正常功能,降低多种酶的活性及DNA和RNA的稳定性,诱发细胞分子(如蛋白质、DNA及脂质)过氧化损伤,促进细胞的凋亡。在脑缺血再灌注损伤的过程中,活性氧存在多种来源途径,其中,NADPH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)氧化酶(NOX)被认为是脑缺血再灌注后活性氧水平异常升高的一个关键因子。目前研究证明在NADPH氧化酶中,NOX2在缺血性卒中中扮演重要角色,与缺血性脑卒中等疾病密切相关。大量研究表明,上调缺血脑组织中NADPH氧化酶的表达会加重脑缺血再灌注损伤,增加神经元死亡,而抑制NOX2的活性可以减轻脑缺血再灌注损伤。"脉为血府,气为血帅",益气能够生血,祛瘀能够生新,活血能够生肌。生血、新、肌就包括生新脉和新络的意义。故脉络的新生无法离开气血,所以益气补血药可以发挥生成血管的功能。所以益气可以生脉。对于中风,古今医家均以促进脑络通畅为最终目的。灯盏生脉胶囊是临床上在治疗脑梗塞等缺血性脑损伤疾病中具有显著疗效的"益气生脉"中成药,我们承担了国际上首个探讨国产品牌中成药对缺血性卒中二级预防作用的大型临床研究-"灯盏生脉胶囊干预缺血中风二级预防的多中心、随机对照、双盲临床试验",结果显示:灯盏生脉胶囊可降低首发症状性脑梗死患者非致死性卒中再发率27.8%,其可有效改善缺血卒中患者残障程度,且不增加脑出血及其它出血性风险,在临床上已广泛用于缺血性心脑血管疾病的防治,灯盏生脉胶囊以灯盏细辛为主药,而灯盏花乙素(Scutellarin)是从灯盏细辛中提取的主要黄酮类活性成分之一,化学名为4’,5,6三羟基黄酮-葡萄糖醛酸苷。近年来基础研究表明灯盏花乙素对脑血管的损伤具有保护作用。那么灯盏花乙素保护脑缺血再灌注损伤的作用机制是什么?本研究利用星形胶质细胞缺糖缺氧模型和大鼠大脑中动脉栓塞模型,探讨灯盏花乙素保护脑缺血再灌注损伤的可能作用机制。目的:通过细胞模型(星型胶质细胞缺氧/再复氧模型)及整体动物(大鼠大脑中动脉栓塞模型,tMCAO)研究灯盏花乙素处理对NOX2及过氧化损伤的改变,明确灯盏花乙素保护脑缺血再灌注后神经损伤的信号机制。方法:1.体外培养原代星形胶质细胞,制备缺糖缺氧/复糖复氧损伤的细胞模型。将星形胶质细胞分为正常对照组、缺糖缺氧/复糖复氧组、Scu低浓度(2 μM)+缺糖缺氧/复糖复氧组、Scu中浓度(10μM/L)+缺糖缺氧/复糖复氧组、Scu高浓度(50 μ M/L)+缺糖缺氧/复糖复氧组。分子对接技术研究灯盏花乙素和NOX2蛋白对接情况;Western Blot检测NOX2蛋白表达情况;活性氧试剂盒检测星形胶质细胞内活性氧含量。2.制备大鼠MCAO动物模型,采用简单随机分组法将SD大鼠随机分为以下几组:假手术组(sham)组、手术组、灯盏花乙素低浓度(50mg/kg)+手术组、灯盏花乙素高浓度(l00mg/kg)+手术组、不同浓度夹竹桃麻素+手术组。Bederson 5分法对大鼠进行神经行为学评分;TTC染色法检测大鼠脑梗死面积的变化;Western Blot法检测NOX2蛋白表达的变化情况;ELISA法检测氧化应激相关指标的变化;免疫组化检测大鼠脑组织中的细胞凋亡情况。结果:1.分子对接研究结果显示灯盏花乙素和NOX2蛋白的活性口袋形状相互吻合,二者的3D分子结构对接良好。原代培养的星形胶质细胞纯度>98%。缺糖缺氧2 h复糖复氧24 h后,灯盏花乙素(10,50 μM)可以改善细胞存活率下降(P<0.05)。Western Blot显示缺糖缺氧2 h后复糖复氧24 h的星形胶质细胞NOX2表达水平高于正常对照组,灯盏花乙素(2,10,50 μM)预处理的缺糖缺氧2 h后复糖复氧24 h的星形胶质细胞中NOX2表达水平与同时间点溶剂对照组相比下降(P<0.05)。缺糖缺氧导致细胞内活性氧水平升高,而灯盏花乙素(10,50 μM)能降低细胞内活性氧的水平(P<0.05)。2.大鼠神经行为学评分、脑梗死面积百分率的检测结果显示,与sham组相比,I/R组大鼠神经行为学评分,脑梗死面积百分率增高(P<0.05),与I/R组相比,Scu(低、高浓度)+I/R组大鼠神经行为学评分,脑梗死面积百分率降低(P<0.05)。3.大鼠神脑组织细胞凋亡及氧化应激相关指标(8-羟基脱氧鸟苷,8-OHdG;4-羟基壬烯醛,4-HNE;3-硝基酪氨酸,3-NT)的检测结果显示与sham组相比,I/R组大鼠免疫组化阳性细胞率和氧化应激相关指标增高(P<0.05)。假手术组、I/R3d组的Caspase-3阳性细胞百分率分别为12.20±1.62%、55.45±4.99%。假手术组、I/R 3d 组的 8-OHdG 分别为 100%、177.2%±31.2%;4-HNE 分别为 100%、163.6%± 28.7%;3-NT 分别为 100%、159.3%±32.1%。与 I/R 组相比,Scu(低、高浓度)+I/R组大鼠免疫组化阳性细胞率和氧化应激相关指标降低(P<0.05)。Scu低浓度组、Scu高浓度组的Caspase-3阳性细胞百分率分别为22.36±3.37%、11.70± 1.79%。Scu 低浓度组、Scu 高浓度组的 8-OHdG 分别为 113.1%±33.1%、99.9%± 11.3%;4-HNE 分别为 112.0%± 32.1%、95.2%± 18.9%;3-NT 分别为 85.6%±31.3%、90.0%±20.5%。4.Western Blot检测NOX2蛋白的结果显示,与sham组相比,I/R组大鼠3d的NOX2蛋白表达水平增高(P<0.05)。与I/R组相比,Scu(低、高浓度)+I/R组大鼠3 d的NOX2蛋白表达水平下降(P<0.05)。夹竹桃麻素+I/R组大鼠3 d的NOX2蛋白的表达水平也下降(P<0.05)。结论:1.灯盏花乙素对缺糖缺氧/复糖复氧诱导的星形胶质细胞损伤具有保护作用。灯盏花乙素能够抑制缺糖缺氧星形胶质细胞NOX2蛋白的表达,降低缺糖缺氧星形胶质细胞内活性氧水平。2.灯盏花乙素能够保护脑缺血再灌注损伤,发挥NOX2蛋白抑制剂的作用。3.灯盏花乙素保护脑缺血再灌注损伤的作用机制与靶向调控NOX2引起的过氧化损伤有关。