研究背景乳腺癌是世界范围内常见的女性恶性肿瘤之一。目前的研究结果显示乳腺癌是一种基因性疾病,其发生发展的过程中往往伴随着一系列原癌基因的激活及抑癌基因的失活,进而可能引起基因上下游的细胞信号传导通路或蛋白质调控网络的异常。抑癌基因近几十年以来一直是全球医学科学家所关注和研究的热点,迄今为止已经有多个抑癌基因如BRCA1,P53等被证实在乳腺恶性肿瘤中可以起到抑制肿瘤的生长,侵袭和转移的作用。目前乳腺癌中抑癌基因研究的两个热点方向是抑癌基因功能及抑癌机制的研究与抑癌基因表达调控机制的研究。而在现有成果基础上进一步研究抑癌基因的功能和影响乳腺癌发生发展的完整机制,并发掘新的乳腺癌相关的抑癌基因作为临床上基因靶向治疗的作用靶点,可能是未来研究的重点与方向。2000年,Tatarelli等从人类正常卵巢组织中克隆出了完整的TES基因cDNA序列。人类TES基因的开放读码框(ORF)长度为1263bp,共有7个外显子,编码一个含421个氨基酸残基,蛋白分子量为48kDa的蛋白。TES蛋白的氨基端含有一个PET结构域,羧基端含有三个串联的LIM结构域(LIM1, LIM2, LIM3),每个LIM结构域又可以形成两个独立的锌指结构。这种特殊的串联LIM结构域与TES蛋白在细胞中的定位和调控细胞生物学行为的功能密切相关。细胞中TES主要分布于黏着斑和细胞间连接的区域,可以与一系列细胞骨架蛋白talin, zyxin, VASP, Mena, EVL, alphaⅡ-spectrin, actin和Arp7A;相结合。TES基因这种多蛋白的结合能力主要依赖于羧基端的LIM结构域。例如：TES的LIM1结构域是zvxin的直接结合位点,而LIM3结构域则与Mena和IVSAP结合同zyxin起形成zyxin-TES-Mena-VSAP复合物,构成细胞间连接的一部分。利用SiRNA技术在Hela细胞中沉默TES基因破坏zyxin-TES-MEna-VSAP复合物可导致肌动蛋白压力纤维富集减少,进而引起与GTP结合的RhoA活性下降从而影响Rho-GTPase通路的活性导致细胞运动性增加,伸展性降低,最终可能使肿瘤细胞的致瘤性增加。以上研究对于明确TES基因的功能以及抑癌机制有重要意义。目前研究发现TES基因在卵巢、前列腺、甲状腺、乳腺、胃、肾、结肠和头颈部实体恶性肿瘤以及白血病中均有表达下调并与肿瘤的发展有关系。TES基因表达及功能异常的主要原因与D7S486位点的杂合子缺失(LOH),启动子区的甲基化,,点突变和TES基因的基因多态性(SNP)有关。在肿瘤细胞中过表达TES基因可抑制肿瘤细胞的增殖,诱导凋亡。突变和甲基化是目前发现的导致TES基因在乳腺癌细胞中失活的主要机制。ZR-75乳腺癌细胞中TES基因编码区的1186bp处存在一个插入胸腺嘧啶的框移突变,使得TES蛋白翻译在第378个氨基酸处提前终止(TES蛋白氨基酸链全长421个氨基酸残基),可能得到一个缺失LIM2和LIM3结构域的截短的TES蛋白,影响其正常功能。T47D乳腺癌细胞系中TES基因的启动子区发生甲基化导致基因沉默,而在T47D中过表达TES基因cDNA可抑制细胞的增殖和克隆形成,将过表达TES基因的T47D细胞原位种植于裸鼠体内发现较之对照组其成瘤率降低,细胞凋亡增加,其机制可能是TES激活了内源性凋亡相关的caspase-3和外源性凋亡相关的caspase-8蛋白的表达从而导致相应的凋亡通路激活。四氢大麻酚(THC)可通过激活转录因子JunD并使之进入细胞核来抑制乳腺癌细胞的增殖,与此同时TES基因的表达上调；而在乳腺癌细胞中干扰JunD后加入THC并不能明显上调TES,说明TES基因可能是THC和JunD的下游作用靶点,能通过抑制乳腺癌细胞的增殖发挥抗癌作用。综上可知尽管目前对于TES基因在乳腺癌中沉默的机制已经有了较多研究,TES基因在乳腺癌中通过诱导细胞凋亡抑制增殖的现象已有初步的发现。但TES基因在乳腺癌中是否仍具有其他方面的抑癌功能以及相应的分子生物学机制,在乳腺癌发生发展中起到何种作用,TES基因的表达是否与乳腺癌患者的预后有关系仍值得进行深入探讨和研究。目的1.通过构建针对TES基因的过表达和干扰载体,利用脂质体转染技术将两种载体分别转染不同的乳腺癌细胞构建TES基因过表达和沉默的乳腺癌细胞系,进而通过细胞和动物实验研究TES基因对乳腺癌细胞增殖,侵袭、血管生成,转移以及成瘤性等生物学行的影响,并进一步探讨TES基因影响乳腺癌发展的分子生物学机制。2.在乳腺癌临床标本中利用免疫组化技术和Western Blot技术检测TES蛋白的表达,结合临床病理资料和随访资料探讨TES基因的表达与乳腺癌发生发展以及预后的关系。方法以人类正常卵巢组织RNA为模板反转录出基因组cDNA,再利用PCR技术克隆TES基因cDNA序列,双酶切PCR产物和pcDNA3.1真核表达载体得到双粘性末端,利用T4连接酶连接PCR产物和线性化载体得到TES基因过表达载体并命名为pcDNA3.1-TES;设计针对TES基因的shRNA干扰序列,根据干扰载体pGPU6-Neo-GFP的使用说明构建TES基因干扰载体并命名为pGPU6-Neo-GFP-shRNA-TES。干扰及过表达载体均通过测序验证。分别用已构建成功的过表达和干扰载体(pcDNA3.1-TES、pGPU6-Neo-GFP-shRNA-TES)及对照的空载体(pcDNA3.1、pGPU6-Neo-GFP)转染人乳腺癌细胞系MDA-MB-468和MCF-7,嘌呤霉素筛选约一个月至未转染载体的细胞全部死亡,得到稳定表达TES基因过表达和干扰载体的细胞系468-TES-OVE、MCF-7-TES-KD及相对应的稳定表达空载体的细胞系468-Control、MCF-7-Control。利用实时定量PCR检测细胞mRNA水平上TES的过表达和干扰效果,Western Blot检测细胞蛋白表达水平上TES的过表达和干扰效果。细胞筛选成功后,用MTT法分别检测过表达TES基因的MDA-MB-468细胞和干扰TES基因的MCF-7细胞及其相对应对照组细胞的增殖效率,绘制增殖曲线。同时将细胞用胰酶消化后以低密度铺在培养皿中,培养2周以后观察细胞存活与克隆形成情况。在细胞侵袭实验中将消化好的468-TES-OVE、468-Control和MCF-7-TES-KD、MCF-7-Control细胞分别种植于铺过基质胶的Tranwell小室的上层；在迁移试验中直接将细胞种植于Transwell小室上层,小室下方加入肿瘤条件培养基(TCM),培养24小时后通过显微镜观察穿过小室的细胞数目来判断细胞的侵袭性和迁移性。使用肿瘤细胞条件培养基在去除生长因子的基质胶上培养人类脐带静脉内皮细胞(HUVEC),培养一段时间后在显微镜下观察毛细血管形成情况。以皮下注射和尾静脉注射的方式分别将过表达和干扰TES基因的MDA-MB-468和MCF-7细胞种植于裸鼠体内,饲养7周的过程中测量肿瘤长宽径计算肿瘤体积,7周后处死裸鼠取得肺脏,计数肺转移灶的数量来评估细胞在活体中的成瘤性和转移性。由于已有文献证实miR-29b可以通过调控MMP-2蛋白的表达来影响肿瘤细胞的侵袭性,转移能力和血管生成的能力,所以我们假设TES基因对于乳腺癌细胞上述生物学行为的影响可能与miR-29b对MMP-2的表达调控有关。利用RT-PCR方法分别检测过表达和干扰TES基因的MDA-MB-468和MCF-7乳腺癌细胞系中miR-29b和MMP-2的mRNA的表达；而后分别在468-TES-OVI和MCF-7-TES-KD中转染miR-29b的抑制剂和类似物,利用RT-PCR检测两种细胞中miR-29b和MMP-2的表达情况,并在Tranwell小室中进行细胞侵袭性和迁移性试验,利用HUVEC做血管形成试验来验证TES调控miR-29b和MMP-2对细胞侵袭性、迁移性和血管生成能力的影响。为证实TES基因与乳腺癌发生发展以及患者预后的关系,我们首先用Western Blot法检测了39例乳腺癌组织与匹配的癌旁正常组织中TES蛋白的表达情况。我们还采用免疫组织化学技术对包括正常乳腺组织,非典型性导管上皮化生(UDH),典型性导管上皮化生(ADH),导管内原位癌(DCIS)和浸润性导管癌及其癌旁正常乳腺组织在内的307例乳腺病理组织切片进行了染色,分析了TES、MMP-2和CD34的表达情况。另外,我们使用了来自耶鲁大学和赫尔辛基大学带有远期随访结果的临床病理数据库分析了TES基因在乳腺癌患者中的表达与乳腺癌患者预后,以及与常见临床病理指标ER、PR、HER2和P53基因表达之间的关系。结果经测序验证我们成功构建了TES基因过表达和干扰载体。分别在人类乳腺癌细胞系MDA-MB-468和MCF-7中转染TES基因过表达和干扰载体,经实时定量PCR及Western Blot检测证实转染成功并筛选出稳定过表达和干扰TES基因的乳腺癌细胞系,且过表达和干扰效果良好。MTT结果显示在TES本底表达量较少的MDA-MB-468乳腺癌细胞中过表达TES可导致细胞的增殖能力和克隆形成能力减弱(P＜0.01),反之在TES表达量较高的MCF-7乳腺癌细胞中干扰TES基因可使细胞的增殖和克隆形成增加(P＜0.001)。Tranwell试验结果显示过表达TES基因可降低细胞的侵袭性(P＜0.01)同时显著降低迁移性(P＜0.001)；而干扰TES基因的MCF-7细胞的侵袭性和迁移性均显著提高(P＜0.001)。在血管形成试验中,当HUVEC细胞使用来自468-TES-OVE的肿瘤条件培养基培养时,形成的毛细血管样结构数量远远少于使用来自468-Control肿瘤条件培养基培养所形成的数量(75.67±7.02vs37.33±5.51,P=0.0017)；而使用来自MCF-7-TES-KD的条件培养基培养HUVEC比起使用来自MCF-7-Control的条件培养基得到的毛细血管样结构明显增多(38.67±4.51vs66.33±7.02,P=0.0046)。在动物实验中468-TES-OVE在裸鼠体内成瘤性较之对照组降低,形成的肿瘤体积较小,且尾静脉注射后在肺部仅有较少转移灶(42.23±7.02vs16.00±3.6,P=0.0045)；MCF-7-TES-KD在裸鼠体内成瘤性较之对照组增强,形成肿瘤的体积也较大,且尾静脉注射后肺部转移灶明显增多(0.67±0.58vs14.34±3.51,P=0.0027)。利用RT-PCR技术在468-TES-OVE和468-Control中检测miR-29b和MMP-2的mRNA水平,结果发现过表达TES可导致miR-29b的mRNA水平明显上升(P＜0.001)并伴随着MMP-2的mRNA水平下降(P＜0.01)；转染miR-29b的抑制剂以后可逆转miR-29b对于MMP-2的抑制作用使得MMP-2显著上升(P＜0.001)。在进行细胞侵袭试验和血管生成试验时转染miR-29b抑制剂,过表达TES造成的细胞侵袭性降低血管生成减少的现象被逆转。相反,在MCF-7乳腺癌细胞中干扰TES基因可导致miR-29b的mRNA水平显著减少(P＜0.001)伴随着MMP-2的mRNA水平显著升高(P＜0.001)。转染miR-29b的类似物后,干扰TES基因的MCF-7细胞侵袭性和血管生成不再增加。上述结果证明TES是特异性的通过调控miR-29b和MMP-2的表达来影响乳腺癌细胞的生物学行为。Western Blot结果显示在39例乳腺癌患者中有31例患者癌组织中TES蛋白的表达较之癌旁正常组织明显下降。免疫组织化学结果显示TES基因在所有正常乳腺组织中表达(50/50,100%)；在几乎所有UDH组织中表达(27/28,96.43%)；有70.59%(12/17)的ADH组织中表达TES蛋白,而仅有约一半的DCIS组织中表达TES(13/25,52%)；在浸润性导管癌的组织中TES蛋白的表达率仅为29.95%(56/187)。统计学分析发现TES基因高表达的乳腺癌患者乳腺无复发生存率,病因特异生存率,远期无转移生存率和总体生存率均高于TES低表达的乳腺癌患者。且TES基因的表达与雌激素受体(ER)的表达密切相关。结论1.在体外实验中利用成功转染了TES基因过表达/干扰载体的乳腺癌细胞证明了TES基因可以抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭、转移和血管生成等生物学行为。2.动物实验进一步在体内证明了TES基因在乳腺癌的生长和转移过程中发挥着抑癌基因的作用。进一步支持了TES基因在乳腺癌中是一个多功能的抑癌基因这一观点。3.TES基因抑制乳腺癌细胞侵袭、转移和血管生成等生物学行为的机制可能是通过调节TES/miR-29b/MMP-2通路。4.TES基因的表达与乳腺癌患者的预后有关系,提示TES基因可以做为个独立的乳腺癌预后判定的分子指标。意义1.进一步研究并证明了TES基因在乳腺癌中的抑癌功能以及与之相关的信号传导通路。2.首次研究并证明了TES基因可以作为一个评估乳腺癌患者预后状况的分子指标。3.为TES基因作为新的乳腺癌基因治疗靶点提供了依据。