高致病性H5和H7亚型禽流感的暴发不仅给养禽业造成重大损失,也给人类的生命健康构成严重威胁,而疫苗免疫是预防禽流感的主动措施、关键环节和最后防线。因此,为了防止H5和H7亚型禽流感在中国的肆虐,重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗(H5N1 Re-8株+H7N9H7-Re1株)于2017年在养殖场中广泛应用。但是,2017年底以来的全国禽流感流行病学调查结果显示,我国H5亚型禽流感病毒以2.3.2.1和2.3.4.4分支为主,并且2.3.4.4d分支和2.3.2.1d分支病毒已成为当前威胁我国养禽业的主要流行株。进一步的抗原性分析和攻毒试验结果表明,Re-8株疫苗株与2018年分离到的2.3.4.4d和2.3.2.1d分支代表病毒株均存在较大抗原性差异,并且在临床上所使用的二价灭活疫苗不能对当时流行的H5亚型高致病性禽流感病毒提供完全保护作用,因此需要将H5N1 Re-8株疫苗种毒进行更新。此外,H7N9 H7-Re1株与分离到的部分H7N9病毒的抗原性差异较大,并且这种差异还在不断增加,因此将H7N9 H7-Re1株疫苗种毒一并进行更新。本研究将构建的H5亚型Re-11株、Re-12株和H7亚型H7-Re2株重组禽流感病毒进行系统鉴定(种毒病毒含量、HA和NA基因的序列分析、对鸡胚和雏鸡毒力、特异性、免疫原性以及纯净性)。此外,我们将3株病毒在鸡胚中传至13代,测定所有代次病毒的鸡胚半数致死量和HA效价。结果表明,H5亚型Re-11株、Re-12株和H7亚型H7-Re2株重组病毒生物安全度高、特异性强、免疫原性好、适合在鸡胚中稳定增殖,病毒液纯净,均符合作为禽流感灭活疫苗种毒要求。随后,我们用Re-11、Re-12和H7-Re2株疫苗种毒制备成重组禽流感病毒(H5+H7)三价灭活疫苗(H5N1 Re-11株+H5N1 Re-12株+H7N9 H7-Re2株),对其安全性和免疫效果等进行实验室研究。结果表明,三价灭活疫苗对SPF鸡、SPF鸭和商品鹅均安全,免疫后无不良反应;3批灭活苗免疫家禽后21d,SPF鸡、SPF鸭和商品鹅的HI抗体效价平均值分别可达到7.7log2、7.7log2和4.2log2以上。三价灭活疫苗免疫鸡用亲本毒株和流行毒株攻击,无发病死亡及排毒现象。当SPF鸡的HI抗体效价达到3log2时,可获得抗死亡保护;达到4log2时,可获得完全保护;SPF鸭H5亚型Re-11株、Re-12株HI抗体≥2log2时可对H5亚型效检毒株攻击提供完全保护,H7亚型H7-Re2株HI抗体≥3log2时,对异源H7N2亚型毒株攻击提供完全保护。最后,进行了临床上蛋种鸡、白羽肉种鸡、北京油鸡、固始鸡、商品白羽肉鸡和种鸭免疫三价灭活疫苗的抗体检测,以评价该疫苗的临床应用效果。结果表明,该疫苗安全性良好,免疫后的家禽均无明显不良反应;该三价灭活疫苗可以诱导蛋种鸡、白羽肉种鸡、北京油鸡、固始鸡和种鸭产生良好的抗体;免疫后的商品白羽肉鸡,在出栏检测时具有较高的抗体效价;疫苗免疫家禽后,可有效预防当前我国流行的H5和H7亚型禽流感病毒引起的禽流感。本研究表明重组禽流感病毒(H5+H7)三价灭活疫苗(H5N1 Re-11株+H5N1 Re-12株+H7N9H7-Re2株)对SPF鸡和水禽均具有良好的安全性和免疫保护效果。并且该三价疫苗已于2019年在全国广泛应用,为控制高致病性禽流感发挥了重要作用。