研究背景和目的：　　 衰老(aging)是一种复杂的生命现象。随着年龄的增长，大脑组织可在形态学结构和神经生化代谢等方面发生一系列改变，由此可能引起脑功能的衰退。已有的证据表明，人和动物衰老过程会出现大量神经细胞丢失，也有证据显示，衰老过程中脑组织的退行性改变也可能与神经病理活神经损伤是有共同的病理过程。这种年龄使然的神经细胞衰退，使得大脑在面对外界病理刺激，如事故所致的创伤等打击下，其抵御及恢复能力也会下降。创伤性脑损伤(traumatic braininjury，TBI)是常见的神经损伤，致残率及致死率均很高。创伤的直接打击引起神经细胞损伤、死亡或延迟性的神经凋亡均可造成脑功能障碍，因此伤者在学习、记忆等能力的下降，使其生活质量受到影响。　　 组织器官中细胞丢失的主要原因为细胞死亡，后者又主要分为细胞坏死和细胞凋亡。由于凋亡是一种基因控制的主动过程，因而凋亡也是个可控的过程，基于凋亡的可控性，对凋亡的抑制比坏死更可行，也更具有生物学意义。细胞的凋亡过程受多种促凋亡和抑凋亡分子的调控，而这些分子又由上游调节分子之间的平衡相互制约。衰老过程或应激条件(创伤)可能会过度激活促凋亡分子或抑制抑凋亡分子的活动或功能，从而诱导凋亡。因此寻找与凋亡有关的调节因子，针对性的进行调控，将有可能成为延缓衰老过程、抑制病理损伤所致的神经功能衰退的重要靶点。　　 X染色体连锁的凋亡抑制蛋白(X-linked Inhibitor of Apoptosis Protein，XIAP)，是细胞内一类特殊的抗凋亡蛋白：XIAP是哺乳动物唯一的内源性线粒体后凋亡抑制蛋白，它通过与促凋亡蛋白Caspase-9或Caspase-3结合来抑制后者的促凋亡作用。研究发现线粒体可以释放两种促凋亡蛋白Smac/DIABLO和Omi/HtrA2，它们均能特异性识别并结合XIAP，使XIAP无法与Caspases结合，从而降低XIAP的抑凋亡作用。　　 Omi/HtrA2是一种进化保守的线粒体丝氨酸蛋白酶，同时也是一种内源性细胞凋亡途径的重要分子。与细胞色素c、凋亡诱导因子(Apoptotic Inducing Factor，AIF)和Smac/DIABLO等其它线粒体促凋亡蛋白质相比，Omi/HtrA2分子结构中还存在有丝氨酸蛋白酶结构域，可以通过其丝氨酸蛋白酶活性直接降解XIAP，发挥促凋亡作用。本研究室的前期研究发现，衰老心脏中Omi/HtrA2的表达增加，同时也参与了衰老大鼠大脑皮层大鼠大脑皮层功能衰退的过程。但在脑组织，尤其是与认知功能密切相关的大脑皮层中，Omi/HtrA2的表达是否有改变及其生物学意义并不清楚。　　 因此，本研究旨在：　　 (1)观察神经凋亡在大鼠衰老过程的作用。　　 (2)观察Omi/HtrA2-XIAP机制在衰老大鼠神经凋亡过程中的作用。　　 (3)观察Omi/HtrA2-XIAP机制在创伤性脑损伤大鼠大脑皮层的神经凋亡过程中的作用。　　 一、衰老大鼠大脑皮层的凋亡及其可能机制　　 目的：　　 1、探讨衰老时大脑皮层的神经凋亡的发生情况及其可能的途径；　　 2、观察衰老大鼠大脑皮层大鼠大脑皮层组织中XIAP、Omi/HtrA2、Smac/DIABLO等凋亡调节蛋白的表达改变，及其在凋亡中的作用。　　 方法：　　 1、随机选取雄性成年组(4-6月龄)和衰老组(22-24月龄)SD大鼠各10只，实验动物由四川省简阳市比尔动物养殖场提供。　　 2、采用Promega公司TUNEL细胞凋亡检测试剂盒厂商说明书逐步处理。再加上Caspase-3活性测定法检测大鼠大脑皮层组织中皮层细胞凋亡发生情况；　　 3、用Western-blot法检测大鼠大脑皮层组织中XIAP、Omi/HtrA2、Smac/DIABLO蛋白水平的表达水平；　　 4、用Real-Time PCR法检测大鼠皮层组织中XIAP、Omi/HtrA2、Smac/DIABLO转录水平的表达水平。　　 5、统计方法：采用SPSS13.0统计软件对数据进行分析，实验结果均以均数±标准差(Mean±SD)表示，两样本均数组间比较采用t检验，结果均以P＜0.05为有统计学意义。　　 结果：　　 1.正常成年和衰老大鼠大脑皮层凋亡水平的比较　　 2.正常成年和衰老大鼠大脑皮层Caspase-8，9，12活性的比较　　 3.正常成年和衰老大鼠大脑皮层组织Omi/HtrA2、XIAP及Smac/DIABLO的蛋白质水平检测　　 4.正常成年和衰老大鼠大脑皮层组织Omi/HtrA2、XIAP及Smac/DIABLO的mRNA水平检测　　 小结：　　 1.大鼠在衰老过程中，大脑皮层神经细胞凋亡明显增加，有可能是脑功能衰退的重要原因之一。　　 2.衰老大鼠大脑皮层细胞的凋亡通路可能以线粒体途径为主，即通过caspase-9的活化引起凋亡。　　 3.衰老大鼠大脑皮层组织中Omi/HtrA2表达明显增高，而XIAP表达明显下降。通过Omi/HtrA2直接的促凋亡作用及对XIAP降解加速，导致凋亡的发生，提示即Omi/HtrA2-XIAP机制发挥了重要作用。　　 二、神经凋亡在创伤性脑损伤中的作用及可能机制　　 目的：　　 1、观察凋亡在大鼠创伤性脑损伤中的作用；　　 2、观察Omi/HtrA2-XIAP机制在创伤性脑损伤引起的神经凋亡中的作用。　　 方法：　　 1、实验动物：随机选取雄性成年(4-6月龄)SD大鼠和老年SD大鼠(22-24月龄)，随机分成4组。实验动物由四川省简阳市比尔动物养殖场提供。　　 2、大鼠自由落体脑损伤模型的建立，及伪损伤组模型的建立。　　 实验采用改进的Feeneys自由落体硬膜外撞击方法。撞击圆锥头端直径为4mm、高为2.5mm。麻醉大鼠后，将其头部固定于立体定向仪上，备皮后沿中线左侧切头皮，分离骨膜，用牙科钻于中线旁2mm，紧挨冠状缝后开一直径5mm的圆形窗，硬膜保持完整。使用致伤冲击力为600g.cm中型损伤力度。伪创伤组仅切开头皮和颅骨开窗，不施加打击。创伤后4小时处死。　　 分别选取雄性成年SD大鼠和老年SD大鼠(22-24月龄)，随机分为2组：　　 ①成年伪创伤组(n=6)　　 ②成年创伤性脑损伤组(n=6)　　 3、大脑皮层Caspase-3活性测定(同第一部分)。　　 4、用Westem-blot法检测大鼠大脑皮层组织中XIAP、Omi/HtrA2、Smac/DIABLO蛋白水平的表达水平。　　 5、统计方法：采用SPSS13.0统计软件对数据进行分析，实验结果均以均数±标准差(Mean±SD)表示，两样本均数组间比较采用t检验，结果均以P＜0.05为有统计学意义。　　 结果：　　 1.创伤性脑损伤后大鼠大脑皮层Caspase-3活性升高　　 2.创伤性脑损伤后大脑皮层神经中Omi/HtrA2、XIAP的蛋白质表达水平检测　　 提示Smac/DIABLO在创伤性脑损伤后，在衰老大鼠大脑皮层对抗凋亡蛋白XIAP没有调节作用(见图17)。　　 小结：　　 1.创伤性脑损伤会引起神经凋亡，这可能是创伤性脑损伤后脑功能衰退的重要机制；　　 2.在创伤性脑损伤引起的神经凋亡过程中，Omi/HtrA2仍然参与了XIAP的调节，即Omi/HtrA2-XIAP机制发挥了重要作用。