刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)能够机会性地感染包括人和家禽在内的几乎所有的温血动物并入侵这些宿主的有核细胞。弓形虫的生活史复杂,感染途径多样,并且弓形虫病可严重影响人类健康和畜牧养殖业的发展。然而,目前尚未研制出预防弓形虫感染的有效疫苗和针对弓形虫组织包囊的有效药物。顶质体是顶复门原虫特有的细胞器,来源于二次内共生。顶质体尽管不进行光合作用,但它包含了多条重要的合成代谢途径。由于人类宿主缺乏质体,故顶质体成为重要的药物靶标。除己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸异构酶外,弓形虫的其它糖酵解酶都有两个亚型。其中,丙酮酸激酶PYK2、磷酸甘油酸激酶PGK2和磷酸丙糖异构酶TPI2均定位在顶质体。PYK2被认为催化磷酸烯醇式丙酮酸为顶质体提供丙酮酸和ATP且PGK2被认为催化1,3-二磷酸甘油酸生成3-磷酸甘油酸并产生ATP。因此,本研究旨在对定位在顶质体的糖酵解酶进行生理功能和进化起源分析,为解析弓形虫顶质体的代谢机制提供理论依据。本研究首先对弓形虫的糖酵解酶进行了定位分析,随后对顶质体的PYK2和PGK2进行功能研究,最后对定位在顶质体的糖酵解酶进行进化分析。具体工作包括以下几个方面:(1)弓形虫糖酵解酶的定位由于此前研究所用的蛋白定位方法有一定的缺陷,故本研究采用原位融合小分子标签的方法对弓形虫的糖酵解酶进行定位分析。已有研究明确表明烯醇酶ENO1和ENO2表达在细胞质和细胞核,醛缩酶ALD1表达在细胞质而ALD2几乎不表达。因此,本研究关注除ENOs和ALDs外的14个糖酵解酶的亚细胞定位。利用CRISPR/Cas9技术介导的定点插入的方法,分别在14个糖酵解酶的C端融合Ty标签或smHA标签,结合间接免疫荧光观察14个融合蛋白的定位,结果表明PGK2、TPI2和GAPDH2均定位于顶质体,PYK2主要定位于顶质体同时也有其它细胞器定位。(2)PYK2/PGK2单敲除虫株和PYK2/PGK2双敲除虫株的构建和功能研究PYK2被认为为顶质体提供丙酮酸和能量而具有重要意义,故本课题首先研究PYK2的功能。利用CRISPR/Cas9技术辅助的同源重组法在RHΔHX虫株中成功敲除了PYK2。空斑实验和复制实验显示PYK2的敲除不影响弓形虫的正常生长。小鼠毒力实验表明PYK2不影响弓形虫的致病力。PGK2是顶质体另一个潜在的产能酶,因此本课题接下来研究PGK2的功能。用同样的方法在RHΔHX成功敲除PGK2,一系列表型实验证明PGK2不影响弓形虫在体内和体外的正常生长。随后,考虑到两个糖酵解酶都可能催化底物产生ATP,故在PGK2单敲除虫株的基础上对PYK2进行再敲除。与野生株比较,双敲除虫株对小鼠的致病力未见明显下降且仅表现出轻微的体外生长缺陷。这些研究结果表明定位在顶质体的PYK2和PGK2在正常培养条件下对弓形虫的生长不是必需的。(3)弓形虫糖酵解酶的进化分析敲除顶质体中的PYK2和PGK2不影响弓形虫的正常生长的实验结果使本课题猜想弓形虫糖酵解酶的重要性与进化来源有关。已报道TgPYKI与植物、藻类的PYK亲缘关系近而TgPYK2与变形杆菌的PYK的同源性高。故本研究对PGK、GAPDH和TPI进行了进化分析。从构建的进化树看,TgPGK2与蓝细菌或藻类亲缘关系较近,而TgPGK1与真菌或酵母的PGK同源性更高;定位于顶质体的GAPDH2与藻类质体或细菌的GAPDH的同源性较高,而定位于虫体胞质的GAPDH1与真菌的GAPDH的同源性更高。但是,弓形虫的两个TPI没有上述TgPGK与TgGAPDH那样明显的进化起源差异。事实上,本研究尝试用直接敲除法对TPI2进行敲除,但未成功,表明TPI2可能对弓形虫的生长至关重要。因此,本课题提出假设认为弓形虫顶质体中一部分糖酵解酶是虫体通过二次内共生获得顶质体这个过程中留下的,这些酶多与原核生物有较高的同源性,同时虫体原本有一套来自真核生物的酵解酶。这些原核生物来源的、定位于顶质体的酶一般不在虫体生长中扮演关键角色。总之,本研究明确了14个弓形虫糖酵解酶的定位,验证了定位于顶质体的PYK2和PGK2不影响弓形虫的正常生长并且表明糖酵解酶的重要性可能与进化来源有关。