锌指蛋白是一类含有锌指结构的蛋白,其中锌指结构通过锌离子与周围的氨基酸残基基团非共价交联,形成稳定的DNA结合结构域。锌指结构发现后的十余年间,陆续有10多类这样的结构被发现。其中,包含最初发现的TFIIIA型锌指结构域的蛋白总数达到人类基因产物的1%左右。通常根据锌指蛋白的结构序列特征与功能,可将其分为9大类,分别为Cys2His2,Cys8,Cys6,Cys3His Cys4,Cys2His Cys,Cys2His Cys5,Cys4,Cys3His,Cys4His Cys3。根据锌指蛋白中围绕锌离子的残基的空间结构,又可将其分为C2H2样锌指、高音谱号锌指、带状锌指、塞结状锌指、类Zn2/Cys6锌指、类TAZ2锌指、锌结合短环锌指与金属硫蛋白锌指,其中前3个组群包含了大多数锌指。自锌指结构首次发现于非洲爪蟾卵母细胞以来,数千种锌指蛋白相继被鉴定出来。结构的多样赋予其强大的功能,在转录及转录后调控,蛋白折叠与装配以及DNA、RNA识别等分子功能基础上,参与调节胚胎发育、机体免疫及肿瘤形成、发展等过程。锌指蛋白作为分布最为广泛的转录因子,在调节生物体功能的过程中扮演着重要角色。ZKSCAN3属于C2H2型锌指蛋白,早期报导于细胞增殖相关的基因筛选研究中。后续进行的研究发现,ZKSCAN3在结直肠癌组织中高表达,而在癌旁组织中低表达,并且免疫组织化学染色的结果也表明,相较于非侵染性的肿瘤组织,ZKSCAN3在侵染性的肿瘤组织中表达更高。另外,ZKSCAN3的敲除明显抑制了结肠癌细胞的生长,过表达ZKSCAN3则促进细胞生长且增加了细胞的耐药性。进一步的研究确定了KRDGGG为ZKSCAN3的DNA结合基序,上调细胞增殖、细胞迁移、血管新生和蛋白水解作用相关的多种基因的表达,并且在其他肿瘤类型如膀胱癌及多发性骨髓瘤中,均有促进肿瘤发展的作用。除此以外,ZKSCAN3被认为是自噬的重要转录抑制因子,抑制与自噬、溶酶体生成相关的一系列基因。ZKSCAN3属于转录调控因子家族,其结构包含锌指结构域,一个KRAB(Krüppel-associated box)结构域与一个SCAN结构域。KRAB结构域是一种强力的转录抑制单元,通常认为其通过蛋白-蛋白相互作用结合于共抑制因子和/或转录因子。体内与体外的实验结果提示,过表达ZKSCAN3可促进肿瘤细胞生长。与此相反,ZKSCAN3敲除则导致细胞生长停滞、衰老加速。近年来CRISPR技术的成熟与发展使其成为基因编辑的重要技术手段,在基因治疗方面展现出极大的潜力。使用该技术敲除肿瘤细胞中的关键分子,可抑制肿瘤的生长及其恶性程度,在肿瘤治疗方面也取得了良好的效果。但现有的方法如慢病毒、腺相关病毒转染,或电转、脂质体转染等方法,都无法完全解决其靶向性递送问题,CRISPR系统递送至生物体仍存有问题。因此,除了考虑ZKSCAN3在肿瘤组织中敲除带来益处,我们仍需检测其在正常组织中敲除对生物体的影响。此外,CRISPR技术随着敲除序列长度的改变,片段越大敲除效率越低,如何针对ZKSCAN3的特性选择合适的靶向序列仍是需要解答的问题。目的:构建Zkscan3 knockout小鼠,通过reporter gene的表达检测Zkscan3在体内的表达情况,并检测Zkscan3基因敲除后小鼠的生理病理变化,明确Zkscan3在正常组织器官中敲除对小鼠的影响。另外,根据Zkscan3的结构特性,研究其不同结构域的缺失对该分子功能的影响,明确该分子的最佳靶向区间。方法:在Zkscan3起始密码子前插入EGFP reporter gene表达框以代替其表达,同时EGFP表达框两端插入loxp位点,通过与相应的Cre工具鼠交配就可以获得在特定组织、器官中恢复Zkscan3表达的小鼠。用流式细胞术与组织免疫荧光的方法检测EGFP在各组织、器官中的表达情况,从而间接了解Zkscan3基因在体内组织、器官的表达范围。另外,克隆小鼠Zkscan3基因,构建慢病毒载体并转染CT26细胞,缺失不同结构域的Zkscan3与GFP形成融合蛋白,通过流式细胞术与细胞免疫荧光技术可初步探究不同结构域的定位与发挥功能的方式。最后,通过RNA-SEQ技术,深入了解缺失功能域的Zkscan3所具有的特性与功能,以及对细胞内其他基因的影响与调控作用。另外,寻找Zkscan3潜在的作用靶标,以比较其在人与小鼠体内功能的相同与差异。结果:成功构建了Zkscan3基因敲除小鼠,初步观测到GFP在小鼠各组织中的表达情况。相较与人源ZKSCAN3特异性高表达于脾脏与扁桃体生发中心,小鼠在皮肤、心脏、肺、肝脏、脾脏与肾等主要脏器中均有表达。Zkscan3基因在各个器官内的缺失并未造成小鼠死亡,敲除型的小鼠生存状况与野生型小鼠没有差异。因此,正常组织器官中ZKSCAN3的非特异性敲除是安全的。此外,根据各结构域缺失后与GFP组成的融合蛋白的表达情况,带有锌指结构域的融合蛋白均可定位于细胞核内,而SCAN结构域和/或KRAB结构域则定位于细胞质中,说明锌指结构区域是ZKSCAN3的最佳靶向区间。特别地,表达有锌指结构域融合蛋白的细胞系,其融合蛋白表达阳性率均远低于相应的无锌指结构域组。另外,对表达zinc finger锌指结构域的RNA-SEQ分析结果表明,锌指结构域本身可上调ZKSCAN3靶基因VEGF的表达,并调控其他靶基因相关基因的表达,说明该结构域具有独立发挥作用的能力。结合表达全长Zkscan3基因CT26细胞的RNASEQ分析结果,我们筛选验证其中的18个靶标基因,real time-PCR的结果表明,Ccl2极可能代表着Zkscan3的另一下游靶基因。