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目的:分离并筛选中药EHW中的抗HBV组分,并研究其在体外的抗HBV-DNA作用,为研究和开发新的抗乙肝药物提供理论及实验依据。 方法:采用D101大孔吸附树脂,使用乙醇-水混合流动相分别梯度洗脱的方法分离提取中药EHW中的有效组分;在体外采用MTT法测定E,F,E*部位以及各洗脱组分对HepG2.2.15细胞的抑制作用,得到各分离组段的TC50,TC0浓度。使用酶联免疫法测定HepG2.2.15细胞在不同培养天数下HBsAg,HBeAg的分泌情况,在分泌呈线性增长的天数内测定各分离组分在TC0浓度下对HepG2.2.15细胞乙肝病毒HBsAg,HBeAg的分泌抑制作用,计算其对抗原抑制的IC50浓度,寻找其中抑制作用最佳的组分。计算各有效组分TI值,评价其治疗安全性;并采用血清药理学法测定组分F3对HepG2.2.15细胞乙肝病毒HBsAg,HBeAg的分泌抑制作用;针对抑制作用较强的组分进行化学成分预试,探讨其中可能存在的各类化合物;使用PCR-荧光探针法对HBsAg,HBeAg抑制作用较强的组分测定其对HBV-DNA的抑制作用。 结果:(1)本实验采用乙醇-水梯度洗脱D101大孔吸附树脂的方法分离提取中药EHW中的有效组分,分离得到部位E与部位F的10%,30%,50%,70%,100%五个浓度的乙醇洗脱段共10个组分;(2)体外抗HBV的作用:无毒浓度下中药EHW的F,E1,E2,E5,F1,F2,F3,F5组分对 HBsAg分泌均体现出一定的抑制作用,其中,E5、F3、F5组分的抑制作用尤为显著,其在40μg/ml浓度下作用8天对HBsAg抗原分泌的抑制率分别为71.43%,71.39%,76.89%。各有效部位抑制作用随着药物浓度的增加而上升,且随着作用时间的增长而上升;中药 EHW F,E1, E2,E3,E4,F3,F4,F5组分对HBeAg的分泌都呈现一定的剂量依赖抑制作用,而E2,E3,E4组分抑制作用较强,最大抑制分别达到了80.28%,73.74%,61.88%,但只有E2,E4的抑制作用呈现时间依赖性。中药EHW各组分的提取物中,对HBeAg有效的组分中E1,E3,F3,F5的TI均比较接近,在3~6之间;E2的TI值最大,为10.61。对HBsAg有效的组分中F5组分TI较大,在4d时为12.46;F3组分的TI在5~6间且在4d即表现出抑制作用。F3组分对HBsAg与HBeAg均有良好抑制作用,且TI在4~5间,F3组分的血清药理学实验结果表明其对HepG2.2.15细胞分泌的HBsAg,HBeAg有一定的抑制作用,且抑制效果呈时间、浓度依赖性,其中10%和20%的含药血清组与4d给药时间的生理盐水空白对照组比较,有显著的差异(P<0.01)。而在给药8d的实验中,各浓度含药血清组与空白对照组相比较,均有显著性差异((P<0.01)。其中F3组分20%含药血清的抑制率最高,4d和8d的抑制率分别可达到20.85%和29.70%;(3)对F3组分进行HBV-DNA抑制试验,通过实验我们发现:F3组分对 HBV-DNA表现出明显的抑制作用,F3组分的高,中,低剂量组对HBV-DNA的抑制作用与对照组相比均有统计学差异(P<0.01),F3组分高剂量组与低剂量组之间存在统计学差异(P<0.01),中剂量组与低剂量组存在统计学差异(P<0.05),而高剂量组与中剂量组之间的差异还有待进一步分析(P=0.064),其化学性质预试提示其成分为糖或苷,皂苷,蒽醌,黄酮。 结论:(1)中药EHW的E1,E2,E3,E4,F3,F5组分体外均有抗HBeAg的作用,其中E1,E2,E3,F3,F5治疗毒性较低,其中E2,E3,E4组分效果较好;(2) E5,F3,F5组分对HBsAg分泌有较强抑制作用;(3)F5组分对病毒抑制较强但对细胞毒性也较强,F3组分是唯一对HBsAg和HBeAg同时有效且毒性较低的组分,且在血清药理学实验中也表现出了一定的抑制作用,给药8d的实验中,各浓度含药血清组与空白对照组相比较,均有显著性差异((P<0.01);(4)各剂量F3组分对HBV-DNA抑制有显著性作用(P<0.01)。本研究为合理开发抗HBV药物提供理论和实验依据。