研究目的：低氧选择性药物是第一类特异性靶向低氧的抗肿瘤药物,替拉扎明(TPZ)是其中的代表性化合物。该药可在肿瘤的低氧区域经生物还原代谢产生对低氧肿瘤细胞有特异性杀伤作用的物质；而在氧气供应充足的细胞中,还原反应无法发生,因而可使正常组织免受伤害,起到特异性杀伤低氧肿瘤细胞的作用。目前,TPZ已在各种体内外临床试验中表现出良好的抗肿瘤活性,但也表现出脂溶性较差、药效不够理想以及毒性较大等缺陷。因此我们通过对一系列TPZ衍生物的抗肿瘤活性进行筛选,旨在寻找具有更好抗肿瘤活性及更低毒性的新型低氧选择性抗肿瘤药物并开展作用机制研究。研究方法：(1)MTT法检测化合物对不同来源的人肿瘤细胞及人正常肝细胞的增殖抑制能力。(2)分子对接实验检测药物对Topo Ⅱ活性的影响。(3)TARDIS实验检测DNA-Topo Ⅱ可切割复合物的形成。(4) Western Blotting法检测蛋白表达。(5)PI单染或Annexin V/PI双染结合流式细胞术检测周期阻滞及凋亡发生。(6)JC1染色法检测线粒体膜电位变化。(7)建立人源性肿瘤裸小鼠移植瘤模型和H22肝癌小鼠模型,检测化合物对裸小鼠移植瘤和H22肝癌小鼠的试验治疗作用。(8)荧光定量PCR法检测mRNA的表达。(9)双荧光素酶报告基因技术检测转录因子的转录活性。(10)免疫沉淀法检测蛋白与蛋白之间的相互联系。(11) siRNA技术沉默相关基因表达。(12)免疫荧光检测蛋白在细胞内的分布情况。(13)电子显微镜技术观察亚细胞结构。(14)免疫电子显微镜技术观察蛋白在亚细胞结构内的定位。(15) ELISA及荧光偏振方法检测药物对AKT、PI3K、EGFR等激酶的抑制作用。(16)免疫组化检测蛋白在瘤组织切片中的分布情况。研究结果：(1)新型低氧选择性化合物Q6抗肿瘤作用及其靶点研究：新型低氧选择性化合物Q6具有广泛的抗肿瘤谱,在多株实体瘤及白血病细胞株上表现出良好的抑制细胞增殖的能力及低氧选择性,特别是在肝癌细胞中这种抑制细胞增殖的能力及低氧选择性尤为突出,优于对照化合物TPZ；同时我们发现Q6对正常肝细胞没有杀伤作用。通过机制研究,我们发现Q6可抑制Topo Ⅱ活性,捕捉并稳定DNA-Topo Ⅱ可切割复合物,是一个比TPZ更强的Topo Ⅱ毒剂。此外我们发现,Q6作为Topo Ⅱ毒剂可继发性的引起DNA双链断裂,并由此介导肝癌细胞发生G2/M期阻滞及线粒体途径诱导的凋亡。同时,Q6在人肝癌Bel-7402移植瘤裸小鼠模型及H22小鼠肝癌模型上均表现出显著的实验治疗作用。(2)新型低氧选择性化合物Q6对HIF-1α的调控机制研究：我们发现在两株肝细胞癌中Q6可下调HIF-1α蛋白表达水平及其作为转录因子的转录活性并呈剂量依赖关系。Q6可通过加速HIF-1α降解达到下调HIF-1α蛋白表达水平的目的,对其蛋白合成水平及mRNA水平均不造成影响。Q6主要通过激活自噬-溶酶体通路而不是泛素-蛋白酶体通路达到降解HIF-1α的目的,并且P62直接参与了这一过程。结论：(1)新型低氧选择性化合物Q6具有比TPZ更强的体内外抗肿瘤活性和低氧选择性,并可通过抑制Topo Ⅱ活性,捕捉并稳定Topo Ⅱ-DNA可切割复合物,引起DNA双链断裂介导的细胞周期阻滞和细胞凋亡。(2)新型低氧选择性化合物Q6通过激活自噬-溶酶体通路达到下调HIF-1α蛋白表达的目的,并且P62直接参与了这一过程。