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研究背景:新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE）是指围生期多种因素产生的窒息进而导致新生儿缺氧缺血性脑损伤（Hypoxic-ischemic brain injury,HIBI）的疾病,可导致不可逆转的神经功能障碍,甚至新生儿死亡。HIBI的发病机制复杂,涉及多种病理生理过程,研究显示缺氧缺血后多种免疫细胞介导的神经炎症反应是导致脑组织损伤的重要机制。The NLR family CARD domain-containing protein4（NLRC4）炎症小体是多蛋白复合物,在免疫炎症反应中起重要的免疫调节和诱导作用。NLRC4通过识别损伤相关分子模式（DAMPs）和病原相关分子模式（PAMPs）,进而激活NLRC4炎症小体,引起下游炎症因子IL-1β和IL-18的成熟和释放,导致炎症级联反应的发生。目前,对HIBI除亚低温治疗及结合一些辅助治疗手段外,尚无明确的治疗方法。本课题推测NLRC4炎症小体可能在HIBI中发挥作用。同时推测靶向NLRC4介导的炎症反应可能有助于HIBI的治疗进展。核黄素（Riboflavin,RF）又称为维生素B2,在奶类、豆制品、动物内脏、绿色蔬菜及蛋类中含量相对较高,是一种水溶性维生素,参与体内氧化还原反应,具有广泛的生理作用。核黄素磷酸钠注射液是核黄素（维生素B2）的水溶性制剂,与核黄素的用途相同,比核黄素易溶于水,使用方便。近年来,核黄素在多种疾病中发挥治疗作用,研究显示核黄素可以减轻缺血再灌注导致的脑组织损伤,在缺血性脑卒中起到明显的治疗作用。然而核黄素在HIBI大鼠脑损伤方面较少研究。因此本实验通过建立Sprague-Dawley大鼠新生鼠缺氧缺血性脑损伤动物模型,是目前研究缺氧缺血性脑损伤最常用的动物模型,来探索NLRC4炎症小体在HIBI中的作用,以及核黄素对HIBI大鼠后的NLRC4炎症小体通路的影响,进而发现核黄素新的临床用途,为HIBI药物治疗提供新的思路。研究目的:探讨分析NLRC4炎症小体通路在新生大鼠缺氧缺血性脑损伤中的发生、发展过程以及核黄素磷酸钠注射液对其的影响。研究方法:1.（1）选择7日龄新生SD大鼠120只,随机分为Sham组、HI组、RF组,每组40只。分为5个时间点测量指标,制造模型后的6h、24h、48h、72h、7d,每组每个时间点随机分8只新生大鼠。（2）HI组和RF组采用改良Rice-Vannuncci法,左侧颈总动脉双向结扎后,8%氧92%氮混合气缺氧处理2.5h,创建HIBI动物模型。Sham组仅仅游离左侧颈总动脉,不结扎,不做缺氧处理。RF组在造模前2h及造模成功后30min内各经腹腔注射核黄素磷酸钠注射液0.5ml/10g。Sham组及HI组注射同体积生理盐水作为对照。（3）在制造模型后6h、24h、48h、72h、7d分别进行心脏灌注固定,断头脑组织取材。2.检测方式:利用HE染色镜下观察各组新生SD大鼠脑组织病理改变;尼氏染色镜下观察神经元损伤程度及脑细胞中尼氏小体数量及颜色的改变。免疫组化检测各组不同实验时间点HIBI脑组织中NLRC4、Caspase-1、IL-1β、IL-18的表达水平变化,及实时荧光定量PCR（q RT-PCR）测定NLRC4在mRNA水平上各时间点的表达情况。3.实验结果:（1）一般表现:Sham组无皮肤颜色及意识状态的改变,平衡力、肌张力等行为能力均正常;HI组与RF组在缺氧15-20 min左右新生SD大鼠出现皮肤颜色改变由红润逐渐青紫苍白、四肢末梢发绀,出现躁动,频繁晃头,呼吸深快;1.5h出现箱内乱窜,自发夹尾并左侧旋转,不易转身,站立不稳,四肢痉挛抽搐;2.5h后精神萎靡,自主活动减少,呼吸浅慢,对外界刺激反应弱,大小便失禁、抽搐昏迷等。（2）HE染色:Sham组:新生SD大鼠各时间点脑组织结构清楚,大脑皮层各细胞分布整齐,形态正常,包膜完整,核仁清晰,无脑细胞变性及坏死改变。HI组:HI后6h可见大脑皮层细胞层数相对略减少,细胞排列相对略疏松紊乱;24h大脑皮层细胞层数减少,细胞排列疏松紊乱;48h大脑皮层细胞层数减少明显,细胞排列明显疏松紊乱,周围细胞间隙明显扩大;72h可见大脑皮层局部病灶细胞出现明显空泡、变性及坏死,细胞碎裂及溶解;7d可见脑组织充血,部分胶质细胞增生。RF组:各时间点可见脑组织结构改变,神经元数量较多,结构尚且规则,神经细胞损伤程度较HI组轻。（3）尼氏染色:Sham组:神经元细胞胞浆胞核清晰,尼氏小体数量、颜色未见显著改变。HI组:HI后6h可见偶有神经元受损,细胞核略偏位,尼氏小体染色相对变浅;24h可见神经元受损较多,尼氏小体染色较稀疏,颜色变浅;48h可见神经元损伤明显,空泡样表现,尼氏小体染色稀疏且色浅,部分存在中央型尼氏小体消失;72h可见神经元明显受损,部分细胞核溶解或偏位,呈空泡样,尼氏小体染色色浅明显且稀疏,部分存在中央型尼氏小体消失;7d可见大脑皮层胶质细胞增生。RF组:各时间点可见脑组织结构改变,神经元细胞损伤,尼氏小体数量减少,但程度均较HI组轻。（4）免疫组化结果:Sham组:NLRC4、Caspase-1、IL-1β、IL-18表达较少,各时间点表达无明显变化,经统计学软件分析不具有统计学意义（P＞0.05）。HI组:NLRC4、Caspase-1、IL-1β、IL-18在6h开始升高,72h达高峰,7d时较前下降,各时间点经统计学软件分析具有统计学意义（P＜0.05）,与Sham组各时间点相比（P＜0.05）,差异有统计学意义。RF组:与假手术组各时间点相比NLRC4、Caspase-1、IL-1β、IL-18表达升高（P＜0.05）,有统计学意义;与HI组各时间点比较,NLRC4、Caspase-1、IL-1β、IL-18均有下降,差异显著（P＜0.05）,有统计学意义。（5）q RT-PCR:Sham组各时间点NLRC4在mRNA水平表达无明显变化,不具有统计学意义。HI组脑组织中在6h、24h、48h、72h及7d,NLRC4在mRNA水平上的表达较Sham组均有统计学意义上的升高;HI组NLRC4在mRNA水平表达6h升高,72h达高峰,后呈下降趋势,72h表达高于HI组其他时间点,具有统计学意义;RF组与HI组对应各时间点比较,NLRC4在mRNA水平上的表达降低,存在差异,具有统计学意义。结论:1.NLRC4蛋白在缺氧缺血性脑组织中被激活,引起下游因子Caspase-1、IL-1β、IL-18表达升高,提示NLRC4炎症小体通路与新生儿缺氧缺血性脑损伤相关,可能参与其发生发展过程。2.核黄素磷酸钠注射液可能抑制NLRC4炎症小体通路的激活,降低其下游因子Caspase-1、IL-18、IL-1β的表达,减轻HIBI中神经炎症的损伤,对于HIBI引起的脑细胞损伤可能具有一定保护作用。