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研究背景布比卡因广泛用于神经阻滞、椎管内麻醉及术后镇痛,可引发短暂性神经综合征、痛觉过敏等神经并发症,严重时可导致细胞通透性改变、细胞水肿、线粒体功能障碍、诱导细胞凋亡程序等,即发生局麻药神经毒性损伤。糖尿病患者中布比卡因所致神经毒性损伤增强,表现为相关并发症增加,但其细胞学机制尚未明确。神经元内钙离子浓度增加可导致细胞内钙超载,对局麻药神经毒性敏感性增强,诱发细胞损伤与细胞凋亡及相应信号通路开放,被认为是布比卡因等局麻药神经毒性损伤的重要原因。但布比卡因通过细胞膜上何种机制介导细胞内钙超载,且如何导致糖尿病状态下的神经毒性损伤增强,目前尚不清楚。研究表明,布比卡因可激活瞬时感受器电位香草酸受体1(Transient receptor potential vanilloid 1,TRPV1),引起钙离子内流。但TRPV1是否介导布比卡因导致的神经毒性损伤;糖尿病状态下布比卡因导致的神经毒性损伤增加是否与TRPV1相关,且高糖环境与糖尿病状态下,TRPV1的活性与表达是否存在异常,有待进一步研究。实验目的本课题通过原代培养的野生型小鼠(Wild-type,WT)与TRPV1基因敲除型小鼠(Trpv1-/-)的背根神经节(Dorsal root ganglion,DRG)细胞,应用钙成像技术验证布比卡因是否通过TRPV1非选择性阳离子通道介导细胞内钙超载;并通过建立体外高糖损伤模型,比较WT与Trpv1-/-小鼠的DRG神经元对布比卡因所导致钙超载的差异,同时检测高糖环境下TRPV1通道的活性变化。为进一步研究糖尿病情况下使用布比卡因致神经毒性损伤增强的细胞学机制,建立WT与Trpv1-/-的2型糖尿病小鼠动物模型,采用动物行为学、免疫荧光染色、定量RT-PCR、蛋白质免疫印迹与Fura-2AM钙成像方法,验证布比卡因是否通过糖尿病状态下数量“上调”的TRPV1受体,或/与功能“上调”的TRPV1受体作用,导致钙超载增强而加重其神经毒性损伤,进一步了解布比卡因通过TRPV1介导神经毒性损伤尤其是糖尿病神经毒性损伤增强的特点,从而为防治布比卡因加重糖尿病神经毒性损伤提供理论依据及药物作用靶点。材料与方法1实验动物所有动物实验均通过南方医科大学动物伦理学论证后实施。本实验所使用WT均为C57BL/6J小鼠。实验所使用Trpv1-/-小鼠为美国圣路易斯华盛顿大学医学院麻醉科赠送。小鼠基因型使用PCR法进行鉴定。实验中需要对不同基因型动物进行行为学比较,采用杂合子配对所繁育的同窝小鼠的WT与Trpv1-/-进行对照。实验过程采用盲测法,测试结果登记分析后,根据小鼠标记的号码结合PCR结果进行查对分组。2钙成像测定布比卡因致DRG细胞内钙离子超载与TRPV1的相关性分离培养3～4 W的WT与Trpv1-/-小鼠DRG细胞。培养24 h后,使用Fura-2AM钙成像方法测定WT小鼠DRG细胞对布比卡因与TRPV1激动剂(辣椒素)的反应,通过340/380的反应比例计算两者的重合率。应用布比卡因持续作用2 min,比较WT与Trpv1-/-小鼠DRG细胞的反应数量、峰值及细胞内钙浓度的曲线下面积。3高糖环境下测定布比卡因所致钙离子浓度与TRPV1的相关性分离培养3～4 W的WT与Trpv1-/-小鼠DRG细胞,培养18 h后,使用高糖培养基与标准培养基处理细胞6 h,形成体外高糖与正常糖浓度的细胞模型。处理后的细胞使用Fura-2AM孵育的钙成像方法,测定布比卡因所致DRG细胞内钙离子浓度在WT与Trpv1-/-小鼠中的差异程度。将高糖与正常糖处理6 h的WT小鼠DRG细胞进行钙成像实验,测定对相同浓度TRPV1激动剂(辣椒素)的反应。4检验布比卡因致糖尿病小鼠模型神经毒性损伤与TRPV1的相关性小鼠高脂高糖饲料喂食3 W后,腹腔注射链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)(100 mg/kg),制作小鼠2型糖尿病模型;对照组喂食普通鼠粮3 W后,腹腔注射STZ的佐剂(0.1 mol/L的柠檬酸缓冲溶液)。STZ腹腔注射后4 W,鼠尾末梢血糖值≥ 10.0 mmol/L为造模成功。对照组与糖尿病小鼠模型的基因型包括WT与Trpv1-/-。对照组与糖尿病模型组小鼠模型建立后,比较WT与Trpv1-/-小鼠鞘内注射布比卡因(15 mM,10 μL)5 h后的Von-Frey机械痛觉过敏测试,计算撤足阈值。分离培养WT与Trpv1-/-对照组与糖尿病组别的DRG细胞24 h,钙成像实验测定不同组别神经元在布比卡因持续作用2 min的钙超载情况。分离培养WT与Trpv1-/-对照组与糖尿病组别的DRG细胞24 h,布比卡因处理3 h后,继续培养至48 h后使用TUNEL法检测神经元凋亡情况。5糖尿病小鼠模型TRPV1的活性与表达检测WT小鼠的2型糖尿病模型制作同前。造模后测定WT对照组与糖尿病组小鼠模型的行为学反应:应用鼠尾浸润实验测定小鼠对热水浴(48℃)的甩尾反应时间:辣椒素足底注射实验测定对照组与糖尿病组WT小鼠的疼痛反应强度。分离培养WT小鼠对照组与糖尿病组的DRG细胞,培养24 h后使用Fura-2AM孵育细胞后进行钙成像实验,测定细胞对不同浓度辣椒素的反应,测定TRPV1阳性神经元的反应活性。TRPV1免疫荧光染色测定TRPV1表达情况:测定对照组与糖尿病组的WT小鼠模型不同组别的TRPV1阳性细胞数量与比例,分析TRPV1免疫染色阳性细胞的数量差异。反转录荧光定量PCR(RT-PCR)测定TRPV1在DRG上的转录情况:采集WT小鼠对照组与糖尿病组的整段脊柱DRG,提取mRNA后通过RT-PCR法测定TRPV1的mRNA转录情况:①依赖反转录酶将RNA反转录成cDNA;②用PCR的方法扩增cDNA;③实时检测和定量扩增的TRPV1产物。所使用TRPV1的扩增引物为:TRPV1-F:5’-CCA CTG GTGTTGAGA CGC C-3’,TRPV1-R:5’-TCT GGG TCTTTG AAC TCG CTG-3’,扩增的 cDNA 片段大小为 167 bp。Western Blot测定TRPV1在DRG上的蛋白表达情况:采集WT小鼠对照组与糖尿病组的整脊柱段DRG,提取蛋白后通过Western Blot测定TRPV1的蛋白表达情况。6布比卡因致DRG细胞钙超载对细胞外钙离子的依赖性分离培养WT与Trpv1-/-的糖尿病组与对照组小鼠DRG,培养24 h后行钙成像,测定不同灌注液中布比卡因引起的钙离子浓度变化。设置两套钙成像灌注液系统,含钙离子灌流液(CIB)与不含钙离子的灌注液(CaF,使用EGTA替代原CIB中的钙离子)同时连接在灌注槽的入口中,以三通旋钮进行不同灌注液的转换。测试不含钙离子的钙成像反应时,使用CaF稀释布比卡因;测试含钙离子的钙成像反应时,使用CIB稀释布比卡因。并测定在含钙离子的灌注条件下,不同浓度布比卡因所激活的DRG细胞比例,制作浓度梯度曲线。7统计学方法所有计量资料以均数±标准差(x±s)表示,统计学采用GraphPad Prism 5.0统计软件分析并作图:采用双尾不对称t-test统计方法,分析所有实验项目中两个组别之间的差异,显著性差异水平设置为P<0.05。采用One-way ANOVA分析三个或三个以上组别之间的差异,显著性差异水平设置为P<0.05。结果1 布比卡因致小鼠DRG细胞内钙离子超载与TRPV1相关1.1布比卡因可致小鼠DRG神经元钙浓度增加将WT小鼠分离培养24h的DRG神经元进行钙成像,结果显示,布比卡因可激活辣椒素(TRPV1激动剂)反应阳性神经元。1.2布比卡因所致钙超载在Trpv1-/-小鼠DRG神经元中下降经过前20 s基础值的观察后,使用布比卡因持续作用2 min。WT的反应曲线为持续上升型,药物作用达峰值后随时间的推移而维持在较高水平,提示细胞内钙离子浓度未能恢复至基础状态;而Trpv1-/-小鼠DRG神经元的反应曲线达峰值后随即下降,两者的曲线下面积统计学有显著差异,P<0.001。2 高糖环境下,布比卡因所致钙离子浓度增加与TRPV1相关2.1高糖环境下,布比卡因所致DRG神经元钙浓度增加具有TRPV1依赖性高糖培养液处理6h后,Fura-2AM钙成像结果显示:WT小鼠的DRG细胞对10 mM布比卡因反应增强,且反应细胞数量增加(P<0.05)。Trpv1-/-小鼠反应阳性的神经元数量无明显变化。此外,WT在正常与高糖培养中,其反应细胞数量均高于Trpv1-/-小鼠(P<0.05)。2.2高糖环境下,神经元对辣椒素反应增强将分离培养的WT小鼠DRG神经元经过高糖培养6 h后进行Fura-2AM钙成像实验。结果显示:高糖培养环境下,辣椒素激活神经元数量明显增加(P<0.05)。3 布比卡因所致糖尿病小鼠神经毒性损伤增加与TRPV1相关3.1高脂高糖饲料联合STZ腹腔注射可诱导小鼠2型糖尿病模型WT与Trpv1-/-小鼠造模前血糖浓度无差异;WT与Trpv1--小鼠糖尿病组第3周与第7周的血糖值均较基础值明显增加,且均较同期对照组血糖明显增加,而第3周与第7周之间无统计学差异(P<0.001)。3.2布比卡因鞘内注射后运动阻滞时间鞘内注射布比卡因(15 mM,10 μL),WT与Trpv1-/-糖尿病模型组运动恢复时间分别较其对照组延长(P<0.05),不同基因型之间比较无统计学差异(P>0.05)。3.3布比卡因鞘内注射后机械痛觉过敏测定鞘内注射布比卡因(15 mM,10 μL)5 h后,WT与Trpv1-/-糖尿病模型组的Von-frey机械痛阈值分别较其对照组下降(P<0.05)。WT的对照组与糖尿病组小鼠模型在鞘内注射布比卡因后,其机械痛阈值均较基础值下降(P<0.05);Trpv1-/-的对照组在鞘内注射布比卡因后机械痛阈值下降(P<0.05),但在糖尿病模型组中,其机械痛阈值变化无进一步下降(P>0.05)。与Trpv1-/-小鼠相比,WT小鼠的对照组及糖尿病组在鞘内注射布比卡因后,其机械痛阈值均下降(P<0.05)。3.4糖尿病小鼠DRG细胞钙成像实验糖尿病组与对照组的WT与Trpv1-/-分离培养24 h后,钙成像实验提示WT与Trpv1-/--糖尿病组小鼠对布比卡因的反应均高于相同基因型小鼠的对照组(p<0.001),其中,WT增加的幅度高于Trpv1-/-(P<0.01)。3.5 TUNEL细胞凋亡糖尿病组与对照组的WT与Trpv1-/-分离培养24 h后,布比卡因1.5 mM处理3 h可导致不同程度的细胞凋亡,TUNEL染色提示,WT的糖尿病组凋亡细胞数量增加(P<0.05),而Trpv1-/-增加不明显(P>0.05)。4 NT小鼠糖尿病模型中TRPV1活性增加4.1糖尿病小鼠的鼠尾温浴甩尾反应增强糖尿病小鼠模型制作同前。造模后测试小鼠鼠尾对热刺激(48℃)的反应性,WT糖尿病小鼠的甩尾反应阈值较对照组降低(P<0.001)。4.2糖尿病组较对照组对辣椒素所致疼痛反应增强小鼠下肢掌侧注射辣椒素后,5 min内糖尿病组躲避次数(P<0.001)与舔爪时间(P<0.01)与较对照组均增加。4.3糖尿病组较对照组的DRG神经元对辣椒素反应增强分离培养24 h的DRG神经元进行钙成像实验,糖尿病组DRG神经元对辣椒素的反应细胞比例较对照组增加(P<0.05)。4.4糖尿病组TRPV1免疫荧光染色阳性细胞无改变DRG冷冻切片的免疫荧光染色提示,糖尿病组L4节段的TRPV1免疫荧光染色阳性的细胞比例较对照组无显著性差异(P>0.05)。4.5糖尿病组DRG神经元TRPV1的mRNA表达与蛋白量无变化WT小鼠糖尿病模型DRG的TRPV1 mRNA表达与TRPV1蛋白量与对照组相比无统计学差异(P>0.05)。5布比卡因激活DRG神经元为细胞外钙离子依赖5.1布比卡因致DRG细胞内钙离子浓度增高为细胞外钙离子依赖性分离培养24 h的对照组与糖尿病组的WT与Trpv1-/-小鼠DRG细胞,分别予以不含钙离子的灌流液与含钙离子的灌流液进行钙成像实验。结果显示,采用不含钙离子的灌流液灌流时,布比卡因并未引起细胞内钙离子浓度增加,而在含钙离子的灌流液中则可引起细胞内钙离子浓度增加。5.2布比卡因致DRG神经元内钙离子浓度增加为剂量依赖型布比卡因剂量依赖性激活分离培养24 h的WT小鼠DRG神经元。不同浓度布比卡因激活的细胞占总细胞数的比例分别为:0.1 mM(35.81±4.10)%,1 mM(66.54±3.49)%,10 mM(65.85±4.23)%。与 0.1 mM 相比,1mM 与 10mM所激活细胞的比例显著性增加(P<0.01),而1mM与10 mM相比较无统计学差异(P>0.05)。结论1.布比卡因可致小鼠DRG神经元细胞内钙离子超载,与TRPV1相关,且为细胞外钙离子依赖。2.高糖环境下,布比卡因致DRG细胞钙超载增加与TRPV1活性增加相关。3.非糖尿病状态下,布比卡因所致钙离子超载、细胞凋亡及机械痛觉过敏与TRPV1相关;糖尿病状态下,布比卡因所致钙离子超载、细胞凋亡及机械痛觉过敏增强,与糖尿病状态下TRPV1活性增加相关。