研究背景和目的2009年我国城市人口中成年人糖尿病发病率已达9.7%,由此推测中国糖尿病患者人数已达9240万,防治工作十分艰巨。而其中90%以上的患者属于2型糖尿病。2型糖尿病发病的主要机制是胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能受损,而后者是2型糖尿病发病的中心环节。造成胰岛β细胞功能受损的病理机制,主要是脂毒性和糖毒性。随着中国人群日常饮食结构的变化,大量脂类食物的摄入,脂质代谢过剩引起的脂毒性的损伤在2型糖尿病的病理进展中起了决定性的作用。脂毒性是指过量的脂质在多个脏器和组织异位沉积并导致其功能损害。糖代谢紊乱常伴有显著的脂代谢紊乱,升高的低密度脂蛋白和糖尿病常同时出现。研究证实,2型糖尿病的发病与糖代谢和脂代谢紊乱有关,升高的甘油三酯,低密度脂蛋白及降低的高密度脂蛋白与高血糖的类型显著相关。而在脂质代谢中,氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)是一种重要的代谢性损伤致病因素,在体内它是由低密度脂蛋白进入血管壁后被内皮细胞、巨噬细胞等生成的氧自由基及酶类氧化而成,可通过多种效应促进动脉粥样硬化的发生。Ox-LDL的细胞毒性引起大量活性氧自由基(ROS)的产生,引起DNA链断裂、损伤。然而,关于Ox-LDL对胰岛的微血管内皮引起的损伤的机制研究还未见报道。在2型糖尿病中,胰岛微循环的损伤可能进一步加重了胰岛β细胞团的损失。胰岛是高度血管化的组织,具有独特的微血管系统,不仅保证了胰岛的血供,而且影响着胰岛激素的合成、分泌功能。其体积仅占胰腺总体积的1%-2%,但与胰腺外分泌组织相比,其毛细血管密度增加了近5倍,血流量占整个胰腺血流量的10%-20%。丰富的血供不仅满足胰岛对氧气和营养物质的需要,而且使胰岛能够迅速感知体内代谢环境的变化,以便分泌各种激素来调节机体代谢平衡。胰岛微血管内皮细胞(Islet microvascular endothelial cells,IMECs)是胰岛微血管的主要组分,覆衬于胰岛微血管内壁,内皮细胞不仅向胰岛细胞供应氧和营养物质,而且在胰岛发育的进程中,诱导胰岛素相关基因的表达,促进β细胞增殖并维持其分泌功能。各种代谢应激因素极易引起细胞DNA的损伤。其中聚(ADP-核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose) polymerase,PARP]为一类DNA修复酶,存在于除酵母外的几乎所有真核生物的细胞中,对细胞的生存、凋亡有重要作用。正常情况下PARP-1的活性很低,PARP-1的活性在DNA损伤时迅速提高,催化受体蛋白的聚ADP核糖基化反应,参与DNA的修复。另一方面氧化应激诱导的PARP-1过度激活,导致快速消耗NAD+,进而消耗ATP,造成细胞功能失调和坏死。此外,PARP-1还是一种重要的转录因子。已经在iNOS启动子-859至-850的位置发现了转录因子PARP-1的结合位点,并发现氧化应激可以促进PARP-1的过度表达且其和iNOS启动子的结合增加。初步的实验结果表明：氧化应激可通过PARP-1来调节iNOS的活性,从而来影响血管内NO合成,引发一系列的血管功能障碍疾病的发生。少量的NO是一个重要的信使分子,而过量的NO可以进一步氧化生成过氧化亚硝酸盐产物,是强烈的致DNA损伤产物。胰高糖素肽-1(GLP-1)是由肠L细胞产生的目前已知作用最强的肠促胰岛素分泌肽。进餐所致高血糖及营养物质的作用促使肠GLP-1分泌,此激素刺激胰岛β细胞分泌胰岛素,自1986年诺克(Nauck)等观察到肠促胰素效应以来,越来越多的研究提示,GLP-1不仅作用于胰腺、肝脏、外周组织,参与血糖调节,还可能作用于中枢、胃肠道、心血管系统等,发挥调节食欲、血压、血脂,改善心功能、内皮功能等作用。GLP-1促进胰岛细胞增殖,抑制胰岛细胞凋亡的作用已有众多报道,但它是否对胰岛微循环系统也能发挥保护作用,对糖尿病病程进展中的淋巴细胞浸润、结构破坏是否也有影响,尚有待我们进一步研究。C57BL/6鼠系经长期高脂喂养虽可产生胰岛素抵抗(IR),但还不能产生明显的高血糖、高胆固醇血症以及广泛的胰岛破坏,这与人类T2DM的临床特征尚有一定差距。ApOE-/-C57BL/6鼠系具有脂代谢紊乱和致动脉硬化的遗传背景。当以长期高脂饲养时,ApOE-/-小鼠空腹血糖升高,胰岛功能受损。因此在这项研究中,我们采用ApOE-/-小鼠作为基本动物模型,给予高脂饮食,建立脂毒性胰岛功能损伤模型。本课题拟围绕GLP-1在干预脂毒性损伤胰岛微血管和胰岛功能中的应用开展研究,研究目的包括：1.建立脂毒性胰岛微血管内皮细胞损伤模型,探索GLP-1通过PARP-1/iNOS/NO的调节通路对胰岛微血管内皮细胞的影响。2.PLVX-AcGFP-N1-PARP-1慢病毒载体的构建及在MS-1细胞中的表达,为在动物模型中过表达PAPR-1奠定基础。3.建立高脂喂养的ApOE-/-小鼠胰岛损伤模型,进一步验证GLP-1通过PARP-1途径对胰岛功能的影响。研究方法第一部分：GLP-1通过PARP-1/iNOS/NO途径保护胰岛微血管内皮细胞利用不同浓度及作用时间的Ox-LDL作用于MS-1细胞(小鼠胰岛微血管内皮细胞系)构建胰岛微血管内皮细胞的损伤模型。应用MTT比色法检测Ox-LDL对MS-1活力的影响,应用Realtime RT-PCR和细胞免疫荧光染色检测PARP-1、 iNOS的表达分布,应用Realtime RT-PCR和Western Bloy检测GLP-1及GLP-1R对Ox-LDL诱导的PARP-1/iNOS mRNA和蛋白表达水平的影响,应用TUNEL法检测Ox-LDL致MS-1细胞凋亡作用。第二部分：PLVX-AcGFP-N1-PARP-1慢病毒载体的构建及在MS-1细胞中的表达从人单核细胞中提取总RNA,逆转录得到cDNA,通过PCR反应得到PARP-1的目的片段,将目的片段与pGEM-T-Easy载体连接,所得质粒进行双酶切鉴定、测序,将酶切好的带有粘性末端的PARP-1目的片段定向克隆到PLVX-AcGFP-N1真核表达载体,再将制备的质粒进行双酶切鉴定。按照Clonetech慢病毒包装试剂盒说明把PLVX-AcGFP-N1-PARP-1包装入293FT细胞,通过荧光显微镜观测293FT细胞内的GFP荧光表达来观察慢病毒载体的转染情况。MS-1细胞共分三组,分别是慢病毒PARP-1组、空载体组(阳性对照组)、空白组(阴性对照组)。荧光显微镜下观察其转染效率,RT-PCR检测PARP-1mRNA的表达。第三部分：高脂喂养对ApoE-/-小鼠胰岛的损伤作用及GLP-1的干预ApoE-/-小鼠分为普食对照组和高脂喂养组,分别喂养4W、8W、16W和32W。期间进行小鼠质量及代谢指标测定,实验末,取血检测血糖、血脂。取胰岛组织HE染色,进行胰岛损伤情况的评估；小鼠胰腺Insulin/Glucagon免疫荧光双标记染色；通过免疫印迹检测PARP-1、iNOS的活性表达。ApoE-/-小鼠分组进行GLP-1和PARP-1抑制剂的干预实验,实验末进行小鼠质量、代谢指标测定和IPGTT/ITT实验检测胰岛功能,进行胰岛损伤状况的评估；小鼠胰腺Insulin/Glucagon免疫荧光双标记染色；通过免疫印迹检测PARP-1、iNOS、 VCAM-1和P-selectin的表达。进一步检测评估各组过氧化亚硝酸盐产物水平。研究结果第一部分：发现Ox-LDL对MS-1细胞有明显的细胞毒性作用,且呈剂量依赖性。MS-1细胞中GLP-1对Ox-LDL引起的iNOS蛋白的表达的抑制效果是由PARP-1的表达所介导的。iNOS的表达水平是随着PARP-1的水平而改变的。GLP-1(100nmol/L)能够显著地抑制iNOS的表达,和PARP-1抑制剂DPQ(30μM), iNOS抑制剂1400W(100μM的)有相似的效果。Ox-LDL能够增加MS-1细胞NO的生成,而GLP-1能够中和这种作用,与DPQ,1400W,的作用相似。Ox-LDL显著增加了MS-1细胞的凋亡率,而GLP-1,DPQ和1400W的预处理则减少了TUNEL阳性的细胞数。GLP-1R在MS-1细胞内有一定程度的表达。给予GLP-1R的拮抗剂(Exendin-(9-39))能够部分抑制了MS-1细胞的凋亡。因此,对于MS-1细胞来说,GLP-1是重要的凋亡抑制因子,它通过GLP-1R引起cAMP的上调,并可能活化蛋白激酶A或其他潜在的途径,如CREBP和NF-κB途径,最终抑制PARP-1/iNOS/NO途径的激活。第二部分：成功克隆出PARP一1编码区全长,经测序证实,无突变、缺失；通过双酶切、连接等步骤构建成pGEM-T-Easy-PARP-1克隆载体；进一步将PARP一1基因克隆至PLVX-AcGFP-N1慢病毒表达载体。使用Clonetech转染试剂盒,将PLVX-AcGFP-N1质粒包装入慢病毒系统,并转染入293FT细胞,通过荧光显微镜观测到293FT细胞内强烈的荧光表达。病毒滴度测定显示嘌呤霉素对293FT细胞的最小致死浓度为10μg/ml,最终测得病毒滴度2X107pfu/ml.荧光显微镜下观察到PARP-1慢病毒载体可以稳定转染MS-1细胞。RT-PCR检测证实重组质粒在MS-1细胞内有mRNA水平的表达。第三部分：与普食组相比,高脂喂养组的ApoE-/-小鼠血浆总胆固醇酯(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)水平明显升高(均P<0.01),并且空腹血糖(FBG)也明显高于普食组,并且随着喂养时间的延长,糖脂代谢紊乱逐渐加重。胰岛HE切片显示高脂组胰岛淋巴细胞浸润明显加重,胰岛破坏随喂养时间增加而加剧。免疫荧光染色显示胰岛的Glucagon分泌增多,胰岛素分泌减少。而分组干预结果显示,PARP-1的抑制剂和GLP-1的应用可以减轻胰岛功能的损伤,并通过抑制粘附因子VCAM-1、P-selectin的表达,来减轻胰岛内淋巴细胞的浸润、破坏,从而改善ApOE-/-小鼠的血糖及胰岛功能。研究结论：1.Ox-LDL可以引起胰岛微血管内皮细胞的凋亡,并且其PARP-1和iNOS的活性及NO的生成水平是升高的。GLP-1可以通过下调PARP-1的表达,减少PARP-1与iNOS的启动子的结合,进而减轻iNOS/NO的大量生成所造成的内皮细胞的损伤。2.成功构建了PARP-1基因编码区克隆载体及含绿色荧光蛋白的PARP-1真核表达载体；PARP-1基因在MS-1细胞中稳定表达,PARP-1基因在MS-1细胞中表达定位于细胞质。3.GLP-1和PARP-1抑制剂可以通过抑制PARP-1/iNOS通路的活性,减少3-NT等氧化应激产物的生成,从而在减少α细胞胰高血糖素水平的同时增加胰岛β细胞胰岛素的生成,同时还可以通过抑制VCAM-1、P-selectin的生成,减轻胰岛淋巴细胞的浸润,从而改善高脂条件喂养下ApoE-/-小鼠的胰岛功能。研究意义：本研究证实氧化低密度脂蛋白对胰岛微血管内皮细胞(MS-1)存在剂量和时间依赖性的细胞毒作用,胰岛微血管内皮有可能是氧化低密度脂蛋白损伤胰岛功能的途径之一。我们还成功构建了PARP-1基因编码区克隆载体及含绿色荧光蛋白的PARP-1真核表达载体；并利用此载体进一步研究了高脂毒性对ApOE-/-小鼠胰岛损伤的机制及潜在的干预策略。GLP-1及PAPR-1特异性抑制剂的干预,可以通过抑制胰岛微血管内皮细胞的凋亡,改善了胰岛血管结构和功能,间接改善胰岛的氧气、营养供应,同时还可以直接抑制胰岛细胞内PARP-1/iNOS通路的活性,从而在减少α细胞胰高血糖素水平的同时增加胰岛β细胞胰岛素的生成,同时还可以通过抑制VCAM-1、P-selectin的生成,减轻胰岛淋巴细胞的浸润和结构破坏。这对于明确PARP-1/iNOS通路在糖尿病病程进展中的致病作用和寻找胰岛微循环及胰岛功能的保护靶点都具有重要的意义和价值。