论文部分内容阅读
富含鸟嘌呤碱基的DNA或者RNA能够形成一种特殊的核酸二级结构:G四链体结构。该结构广泛存在于真核生物、原核生物以及病毒的基因组中,具有重要的生物学功能,如影响DNA的复制、转录和翻译,参与了众多的生理病理过程。伪狂犬病(pseudorabies,PR)是由伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)引起的一种仔猪致死率高,怀孕母猪流产,并伴有神经紊乱症状的急性传染病。PRV基因组的GC含量高达70～80%,我们推测该病毒的基因组中存在形成G四链体结构的序列。EPO作为PRV的一个早期蛋白,对病毒其他基因的表达具有非常重要的调控作用,然而目前关于EPO基因的表达调控还知之甚少。通过生物信息学分析,我们发现EPO基因的启动子区域存在富含鸟嘌呤碱基的序列,该序列包含三个重叠的Sp1结合位点。圆二色光谱和凝胶电泳分析,发现该序列可以形成G四链体结构。硫酸二甲酯足迹保护试验和Taq聚合酶延伸阻滞试验表明,该序列的G四链体结构具有多态性。进一步利用FRET melting、凝胶电泳、以及Taq聚合酶延伸阻滞试验的方法,验证了小分子配体PDS可以诱导形成并且稳定G四链体结构。荧光素酶报告基因试验发现,G四链体结构对EPO启动子活性具有负调控作用。EPO启动子区域中的Sp1结合位点的突变导致了其启动子活性的降低。为了探索该机制,接下来我们检测细胞转录因子Sp1对含有G四链体结构和不含G 四链体结构DNA的识别和结合能力的差异。我们将Sp1基因与六种增加蛋白质可溶性的标签连接构建原核表达载体,并通过原核表达系统纯化目的蛋白,得到了纯度较高的融合蛋白 MBP-Sp1。通过凝胶迁移率试验(EMSA)发现:与不含G四链体结构的双链DNA和单链DNA相比,Sp1蛋白倾向结合含有G四链体结构的双链DNA和单链DNA。过表达或者敲减细胞内的细胞转录因子 Sp1基因,荧光素酶报告基因试验发现,细胞转录因子Sp1对EPO基因的表达具有重要的调节作用。最后我们检测小分子配体对PRV增值的影响。流式细胞仪分析发现小分子配体PDS和BRACO19主要抑制PRV生活周期中的复制阶段。在PRV HN-1201感染的细胞中加入PDS,发现PDS抑制立即早期基因IE180、早期基因EPO、TK以及毒力基因gB 的表达,并且降低病毒滴度,具有抗病毒作用。综上所述,EPO基因启动子的富含鸟嘌呤序列能够形成G四链体结构,该结构不仅对EPO启动子的活性具有负调控作用,而且影响细胞转录因子Sp1对其的识别和结合,小分子配体PDS能够稳定EPO启动子形成的G-四链体结构,并且抑制PRV在细胞内的复制。该研究首次从核酸结构的角度阐述调控EPO基因表达的分子机制,也为研究新型的抗PRV靶点提供理论基础。