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神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)是小儿最常见的颅外肿瘤,起源于肾上腺的肾上嵴,约占小儿所有恶性肿瘤的10%,其恶性程度高,病程进展快,多数病例发现时已为Ⅲ、Ⅳ期。目前,虽然随着综合治疗措施(如手术前的放化疗、化疗加用造血干细胞移植等)的实行,但神经母细胞瘤的治愈率并没有明显提高,Ⅳ期患儿的2年生存率仅为19%,而对于复发、转移的晚期患儿多在短短数月内死亡。寻找更有效的神经母细胞瘤的治疗手段是提高其治愈率所急需的。2010年开始,我们利用溶瘤病毒携带小干扰RNA或抑癌基因IL-24及IL-24重组蛋白等,研究其对神经母细胞瘤的治疗作用。结果显示IL-24能够有效抑制神经母细胞瘤的生长、诱导凋亡,同时能够抑制神经母细胞瘤细胞的侵袭转移,更感兴趣的是我们发现IL-24重组蛋白能够诱导神经母细胞瘤细胞的分化。研究结果发表在Journal of Interferon&Cytokine Research、tumor Biology、oncology report。本课题拟研究在前期研究溶瘤病毒ZD55-sh MYCN及IL-24治疗神经母细胞瘤的基础上,为增强溶瘤病毒靶向感染肿瘤干细胞能力,用35型腺病毒Fiber的knob结构替换5型腺病毒的knob结构,为进一步提高病毒的治疗效果,携带IL-24基因作为治疗基因,构建新型溶瘤病毒ZD55.F35-IL.24。在细胞和动物水平检测ZD55.F35-IL.24对神经母细胞瘤-肿瘤干细胞的治疗效果,为进一步临床应用研究奠定基础。本研究分以下三部分阐述:第一部分溶瘤病毒ZD55.F35-IL.24的构建及扩增纯化目的:利用携带IL-24基因的溶瘤病毒穿梭质粒p ZD55.IL-24和Ad5/35嵌合型纤毛的溶瘤病毒骨架质粒p BHGE3-knob5/35共转染293细胞包装成完整的新型溶瘤病毒ZD55.F35-IL.24,并鉴定和扩增。方法:将293细胞铺于10cm平皿,按细胞转染试剂盒说明书进行操作。将穿梭质粒p ZD55.IL-24等分别与骨架质粒p BHGE3-knob5/35通过Effectene共转染至293细胞,9-14天出现病毒空斑,经过病毒空斑纯化,进行扩增,提取重组腺病毒的DNA。病毒DNA的抽提按照试剂盒说明书进行操作,获得重组病毒ZD55.F35-IL.24。通过PCR分别鉴定病毒中是否插入IL-24、及35型Fiber。鉴定正确的病毒分别感染293细胞,扩增病毒,Cs Cl梯度离心法纯化病毒,50%组织培养感染量(TCID50)法测病毒滴度。结果:穿梭质粒p ZD55.IL-24等分别与骨架质粒p BHGE3-knob5/35通过Effectene共转染293细胞,病毒空斑纯化并扩增,获得重组腺病毒的DNA。以重组病毒基因组为模板PCR扩增获得IL-24基因和Fiber基因,说明溶瘤病毒ZD55.F35-IL.24重组成功。将ZD55.F35-IL.24感染293细胞扩增病毒,Cs Cl梯度离心纯化病毒,-80℃保存备用。结论:成功构建新型溶瘤病毒ZD55.F35-IL.24,并进一步扩增、纯化病毒,为下一步实验奠定基础。第二部分神经母细胞瘤细胞BE(2)-C中干细胞分选、鉴定目的:无血清悬浮培养法和免疫磁珠分选法相结合从人神经母细胞瘤BE(2)-C细胞系中诱导培养肿瘤干细胞并分选鉴定。方法:神经母细胞瘤BE(2)-C细胞接种于含多种生长因子的无血清细胞培养液中,通过诱导培养获得含有大量神经母细胞瘤干细胞的干细胞球。细胞免疫荧光检测神经母细胞瘤干细胞标志蛋白CD133和Nestin的表达。进一步将干细胞球制成单细胞悬液,用CD133标记的免疫磁珠对细胞悬液中的神经母细胞瘤干细胞进行分选。MTT法和细胞单克隆形成率实验检测分选的CD133+和CD133-的细胞的增殖活性。结果:在含血清的完全细胞培养液中,BE(2)-C细胞贴壁生长,增殖快。在含多种细胞因子的无血清细胞培养液中,48小时内,BE(2)-C细胞大部分贴壁生长,少部分细胞呈单细胞悬浮状态。48小时后,开始形成小细胞团悬浮于培养基中,随着培养时间延长,细胞团逐渐增大,形成典型的神经母细胞瘤干细胞球。细胞免疫荧光检测证明干细胞球上高表达CD133和Nestin蛋白。流式细胞仪检测结果示免疫磁珠分选获得的CD133+细胞比例达到93.8%。MTT检测结果示CD133+细胞的增殖能力显著强于CD133-细胞;同时CD133+细胞单克隆形成率也显著高于CD133-细胞,后者几乎不能形成典型干细胞球。结论:经含多种生长因子的无血清细胞培养液诱导培养,BE(2)-C能够形成典型的神经母细胞瘤干细胞球,其表面高表达CD133蛋白,进一步利用免疫磁珠分选获得高纯度的CD133+神经母细胞瘤干细胞,初步检测其增殖能力强。第三部分溶瘤病毒ZD55.F35-IL.24对神经母细胞瘤干细胞生物学特性的影响目的:研究溶瘤病毒ZD55.F35-IL.24对CD133+的神经母细胞瘤干细胞的增殖和分化的影响。方法:溶瘤病毒ZD55.F35-IL.24感染CD133+神经母细胞瘤干细胞,并做如下检测:Western blotting检测IL-24蛋白表达,研究ZD55.F35-IL.24对CD133+神经母细胞瘤干细胞靶向感染和复制能力;MTT实验检测溶瘤病毒ZD55.F35-IL.24对CD133+神经母细胞瘤干细胞的增殖影响;细胞形态学观察及western blot检测Neu N和GFAP的表达,研究ZD55.F35-IL.24对CD133+神经母细胞瘤干细胞分化的影响;流式细胞分析研究ZD55.F35-IL.24对CD133+神经母细胞瘤干细胞中CD133表达的影响;裸鼠移植瘤成瘤实验检测ZD55.F35-IL.24对CD133+神经母细胞瘤干细胞成瘤能力的影响。结果:ZD55.F35-IL.24感染CD133+神经母细胞瘤干细胞高表达IL-24,说明ZD55.F35-IL.24能够靶向感染CD133+神经母细胞瘤干细胞并在细胞内高效复制表达IL-24蛋白。MTT实验结果示溶瘤病毒ZD55.F35-IL.24能够明显抑制CD133+神经母细胞瘤干细胞的增殖。经ZD55.F35-IL.24感染的CD133+神经母细胞瘤干细胞在无血清并添加多种生长因子的细胞培养液中培养七天后,细胞形态变化多样,突起变细增长;神经元标记物Neu N及星形细胞标记物GFAP蛋白的表达明显增高,而神经母细胞瘤干细胞标记物CD133的表达显著降低,说明ZD55.F35-IL.24能够诱导神经母细胞瘤干细胞分化。经ZD55.F35-IL.24感染的CD133+神经母细胞瘤干细胞裸鼠成瘤能力明显降低。结论:溶瘤病毒ZD55.F35-IL.24能够靶向感染CD133+神经母细胞瘤干细胞并在细胞内高效复制,抑制细胞增殖,诱导细胞分化,降低细胞成瘤能力。这些研究结果为溶瘤病毒治疗神经母细胞瘤提供新思路和方法。