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猪细小病毒1型(Porcine parvovirus 1, PPV1)可导致母猪繁殖功能性障碍,给全球的养猪业带来了巨大的经济损失。近年来国内外陆续报道出多种新型的猪细小病毒,其中包括猪细小病毒2型(Porcine parvovirus 2, PPV2)、猪细小病毒3型(Porcine parvovirus 3, PPV3)、猪细小病毒4型(Porcine parvovirus 4, PPV4)、猪类博卡病毒(Porcine boca-like virus, PBo-likeV)和猪博卡病毒(Porcine bocavirus, PBoV)等。本研究同时对上述五种新型猪细小病毒在国内的流行概况和变异程度进行了调研,丰富了其分子流行病学参考资料；利用大肠杆菌表达系统和昆虫杆状病毒系统同时表达了PPV3VP2完整蛋白和截短蛋白以研究其免疫原性,为PPV3亚单位疫苗的研发奠定了理论基础：利用PPV3重组VP2蛋白pET-28a-540建立了间接ELISA方法,为PPV3的检测提供了血清学检测手段。具体研究内容如下：1.新型猪细小病毒的分子流行病学调查本研究对2008～2013年期间的308份送检病料进行了PCR检测,结果显示PPV2、 PPV3、PPV4、PBo-likeV和PBoV的检出率依次为46.4%、21.1%、6.8%、12.3%和5.5%。结合同批病料的PRRSV和PCV2检测结果进行初步分析,结果显示PPV3和PRRSV混合感染的几率为43.1%(28/65),PBo-likeV和PCV2混合感染的几率为78.9%(30/38),提示它们在感染过程中可能存在着协同作用。比对测序结果并绘制截短结构基因的进化树,显示PPV3、PPV4和PBo-likeV的序列高度保守,而PPV2和PBoV的序列则有较大幅度的变异。2.猪细小病毒3型结构蛋白的原核表达与免疫特性研究本研究将不同大小的PPV3 VP2基因克隆入原核表达载体pET-28a,利用E.coliBL21分别表达重组蛋白pET-28a-540、pET-28a-555和pET-28a-VP2, SDS-PAGE结果显示三种蛋白均能正常表达且以包涵体的形式存在,利用包涵体洗液纯化得到了高纯度的重组蛋白,其中以蛋白pET-28a-540勺纯度最高。为研究其免疫原性,利用弗氏佐剂将三种蛋白分别制成亚单位疫苗,依次命名为Sub-28a-540、Sub-28a-555和Sub-28a-VP2。小鼠免疫试验显示,免疫Sub-28a-VP2的小鼠抗体效价显著性高于(P<0.05)免疫Sub-28a-555的小鼠,而免疫Sub-28a-540勺小鼠抗体效价居中。3.猪细小病毒3型结构蛋白的真核表达与免疫特性研究本研究将不同大小的PPV3 VP2基因克隆入真核表达载体pFastBacDual,构建了重组杆状病毒pFastBacDual-540、pFastBacDual-555和pFastBacDual-VP2,经SDS-PAGE和Western blot鉴定,三种VP2基因均能在重组病毒中表达。为进一步研究三种蛋白的免疫原性,大量增殖病毒pFastBacDual-555和pFastBacDual-VP2后进行蛋白纯化,将纯化的蛋白分别制成亚单位疫苗并免疫小鼠。免疫后不同时间采血,测定抗体滴度和细胞因子浓度：间接ELISA检测结果表明,两组疫苗均能诱导机体产生较高水平的特异性抗体；夹心ELISA检测结果表明,免疫蛋白pFastBacDual-VP2的小鼠体内IL-4和IFN-y的浓度均显著性升高(P<0.05)。结果显示蛋白pFastBacDual-VP2可以同时诱导机体产生体液免疫应答和细胞免疫应答。4.猪细小病毒3型间接ELISA抗体检测方法的建立和应用本研究以纯化的重组蛋白pET-28a-540作为包被抗原,利用方阵滴定法建立了PPV3间接ELISA抗体检测方法。确立的反应条件为：最佳抗原包被浓度为0.5μg/ml,最佳血清稀释度为1：100,最佳抗原包被条件为37℃ 1h,最佳封闭液为含5%脱脂奶粉的PBST,最佳封闭条件为37℃ 2h,血清最佳反应条件为37℃1h, HRP-SPA的最佳稀释度和最佳反应条件分别为1：20000和37℃30min, TMB最佳反应条件为·37℃避光作用6min。依据统计学方法确立了阴阳性血清的判定标准：P/N>2.1且OD450nm>0.318的为阳性,OD450nm<0.277的为阴性,0.318>OD450nm>0.277的为可疑。特异性试验表明该抗原与CSFV、FMDV、PCV2、PRV、PRRSV标准阳性血清无交叉反应,显示出高度的特异性；批内和批间重复性试验结果的变异系数分别低于5%和10%,显示出良好的重复性。采用该方法对376份临床血清进行检测,结果显示其中105份呈现PPV3抗体阳性,阳性检出率为27.9%。本研究从病毒分子流行病学、结构蛋白的免疫特性和血清学诊断方法等方面对新型猪细小病毒进行了初步研究,为其致病机理、生物学功能和免疫学特性等方面的系统研究奠定了理论基础。