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第一部分:HDACi联合PD-1抑制剂治疗非小细胞肺癌效果及机制研究目的:PD-1/PD-L1信号通路可通过多种机制抑制T细胞功能,导致肿瘤免疫逃逸。PD-1/PD-L1抑制剂已逐渐发展为非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC）患者的主要治疗手段之一,然而临床上PD-1/PD-L1抑制剂单药治疗NSCLC有效率低下。联合治疗是提高响应率、扩大获益人群的有效方式。大量临床研究提示PD-L1表达水平升高与PD-1/PD-L1抑制剂有效率正相关,同时也是许多抗肿瘤药物的耐药机制之一。本研究拟从传统抗肿瘤药物中筛选出能够上调NSCLC细胞PD-L1表达的药物并验证该药与PD-1/PD-L1抑制剂联用具有协同效应,并从机制上探索该药物上调PD-L1的具体分子机理,最终为PD-1/PD-L1抑制剂联合治疗NSCLC的策略提供新的思路和理论基础。材料与方法:MTT细胞毒性试验筛选合适的药物处理浓度后,以是否能上调人源NSCLC细胞系A549的PD-L1表达水平为筛选指标,分别通过q RT-PCR、Western Blot和流式细胞术在m RNA、蛋白和细胞膜表面水平考察了多种常用的抗肿瘤药物包括Cisplatin、Paclitaxel、Vinorelbine、Irinotecan、Doxorubicin、Gemcitabine、Capecitabine、Afatinib、Sorafenib、Idelalisib、Trametinib、Decitabine和Vorinostat。之后通过构建基因敲除细胞系,q RT-PCR、Western Blot、si RNA文库等技术分别在转录和转录后水平继续探索所选药物上调PD-L1表达的分子机制。同时,构建PD-L1 KO细胞系,在免疫功能健全的小鼠LLC或LLCPD-L1-荷瘤模型上验证经筛选的抗肿瘤药物可通过上调PD-L1表达增强PD-1/PD-L1抑制剂对NSCLC的治疗效果。结果:细胞毒性筛查确定用于处理A549细胞的抗肿瘤药物浓度均不超过10u M。在此浓度范围下,多种抗肿瘤药物均可在m RNA或蛋白层面上调PD-L1表达水平,但在流式分析结果中只有HDAC抑制剂Vorinostat能显著提高细胞膜表面的PD-L1表达。进一步利用HDAC si RNA文库、sh RNA等技术研究发现Vorinostat是通过抑制HDAC3亚型显著升高含CKLF样MARVEL跨膜结构域超家族基因6（CKLF like MARVEL transmembrane domain containing 6,CMTM6）的转录水平,CMTM6能够在细胞膜上稳定PD-L1分子,防止PD-L1的内吞、溶酶体消化和泛素化降解过程,从而上调PD-L1在细胞膜表面的表达。敲除CMTM6后Vorinostat对PD-L1表达上调的诱导作用下降。MTT细胞增殖实验证实PD-L1敲除不影响细胞增殖。小鼠荷瘤模型中,Vorinostat单药治疗能够在一定程度上减缓WT组小鼠肿瘤的生长但是无法改变肿瘤生长的趋势。PD-1抗体在早期能够很好的控制肿瘤生长,但是在接瘤25天后肿瘤开始复发;PD-L1 KO组结果类似。而联合治疗组,在整个观察期内,肿瘤体积无增大趋势,未发现肿瘤复发的迹象;PD-L1 KO+Vorinostat组结果类似。结论:HDAC抑制剂Vorinostat通过作用于HDAC3亚型,调节CMTM6表达,进而上调细胞膜表面PD-L1。HDAC抑制剂对PD-L1的上调作用是其与PD-1/PD-L1抑制剂协同治疗NSCLC有效机制之一。HDAC抑制剂联合PD-1/PD-L1抑制剂有望成为NSCLC的治疗新选择。第二部分:基于TCGA、GEPIA、TIMER等数据库探索CMTM6在肺腺癌中的免疫调节作用目的:免疫治疗是NSCLC主要治疗手段之一,而PD-1/PD-L1抑制剂则是NSCLC免疫治疗研究热点。多个临床研究均提示PD-L1表达水平与PD-1/PD-L1抑制剂疗效密切相关,是目前预测NSCLC中PD-1/PD-L1抑制剂疗效最重要的生物标记物之一。CMTM6作为近期发现的PD-L1上游重要调控因子,可稳定PD-L1在细胞膜表面的表达,有重要研究价值。肺腺癌为NSCLC乃至肺癌中最常见的病理类型,本文旨在利用TCGA、GEPIA、TIMER等数据库探索肺腺癌中CMTM6的表达水平及其可能的生物学功能。材料与方法:从TCGA数据库中下载肺腺癌样本转录组数据及临床数据,基因表达的转录组数据采用TPM标准化处理。GEPIA数据库分析CMTM6在肺腺癌样本与正常肺组织样本的表达差异。Kaplan-Meier曲线和Log-rank检验评估CMTM6表达水平对肺腺癌预后的影响,最佳cut-off值采用R语言的survminer包的“survcutpoint”功能确定,研究指标包括OS、PFS。Wilcoxon秩和检验和卡方检验分析CMTM6表达与肺腺癌临床病理及分子特征的相关性。通过分析CMTM6表达与免疫细胞浸润丰度及以PD-L1为代表的免疫检查点的相关性评估CMTM6免疫调节作用。以CMTM6表达值作为表型进行基因排序,利用GSEA方法对与CMTM6表达相关的基因进行基因集通路富集分析,并利用GO\KEGG\HALLMARK数据库进行注释。筛选下载含免疫治疗数据的数据集,初步评估CMTM6表达水平对免疫治疗疗效的预测作用。结果:TCGA数据库共筛选出510例肺腺癌样本。样本的中位年龄66岁,其中男性235（46.1%）例,白种人385（75.5%）例,422（82.8%）例有吸烟史,297（58.2%）例为右肺癌。TCGA数据库纳入的肺腺癌样本大部分为早期样本,TNM I-II期样本比例为77%,具体:T1、T2期患者443（86.9%）例,N0期、M0期分别占64.1%、67.3%。接受化疗的患者比例为34.7%。TPM标准化后CMTM6、PD-L1表达水平的中位值分别为91.66、6.99,平均值分别为97.67、13.31。GEPIA数据库中,对比分析CMTM6在肺腺癌样本与正常肺组织样本中的表达差异,结果显示肺腺癌中CMTM6表达水平显著高于正常肺组织。CMTM6高表达患者OS更差,但未表现出统计学差异（Log-rank检验:P=0.11）,PFS则显著低于CMTM6低表达患者（Log-rank检验:P=0.017）。CMTM6的表达水平与除了T分期之外的临床特征如年龄、性别、种族、肿瘤分型与部位、吸烟状态、N分期、M分期、TNM分期、PS评分等均无关。免疫相关分析中,CMTM6表达水平与CD8+T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞的浸润丰度显著相关,而与B细胞、CD4+T细胞免疫浸润丰度无关。CMTM6表达也与以PD-L1为代表的数十种免疫检查点表达显著相关,其中大部分为正相关。GO、KEGG、HALLMARK三个数据库对GSEA富集的基因集注释分析,所有显著富集的基因集均与CMTM6表达正相关。筛选三个数据库中均显著富集的基因集,CMTM6表达与肺腺癌组织中炎性反应、细胞因子信号、抗原提呈及处理、免疫细胞增殖及功能调节（如调节性T细胞的增殖、调节NK细胞的细胞杀伤作用）等通路活性显著相关。三个免疫治疗数据集中,CMTM6高表达组与低表达组相比,OS有延长趋势,临床缓解率比例呈增高趋势。结论:CMTM6在肺腺癌组织中的表达显著高于正常肺组织,且CMTM6高表达组生存结局有更差的趋势,OS较低表达组有所缩短,但无统计学差异,PFS则显著降低。CMTM6具有明确的免疫调节作用,与多种免疫检查点表达及免疫细胞浸润显著关联,GSEA富集分析CMTM6表达与肺腺癌炎性反应、细胞因子信号、抗原提呈及处理、免疫细胞增殖及功能调节等信号通路活性显著相关。此外,CMTM6表达水平对免疫治疗疗效具有一定的预测作用。CMTM6可能在肺腺癌抗肿瘤免疫中具有重要作用,是潜在的治疗靶点。