第一章野黄芩苷对代谢综合征小鼠的一般情况、糖脂代谢、炎症及胰岛素抵抗的影响目的：探讨长期高脂饮食对小鼠的一般情况、糖脂代谢、炎症及胰岛素抵抗以及野黄芩苷对此的防治作用。方法：选取103只8周龄,体重在23.5-27.5g的雄性C57BL/6J野生型小鼠为实验对象。饲养期间中心温湿度恒定(温度：23+2℃,湿度：60±5%)。每日光照时间为7am-7pm。动物给予自由进食进水。采用高脂饮食诱导代谢综合征模型。根据饲料不同将实验小鼠分为4组。正常对照组(Control, n=27):给予普通饲料；模型组(Model, n=29):给予高脂饲料；正常干预组(Control+SC, n=25)与模型干预组(Model+SC, n=22):在各组基础饲料中添加0.5%的野黄芩苷。实验小鼠共诱导29周。每周均记录小鼠的体重和摄食情况。每5周对所有小鼠进行眶后静脉丛采血,分离血清,用于监测小鼠糖脂代谢情况。实验结束前1周进行糖耐量及胰岛素耐量实验,评价胰岛素抵抗情况。实验结束时,隔夜禁食,次日检测小鼠空腹体重、腹围及身长,计算Lee’s指数[Lee’s指数=体重(g)1/3*1000’身长(cm)。]。留取空腹血清用于检测血清胰岛素及计算HOMA-IR指数[HOMA-IR=血糖水平[mmol/L]*血清胰岛素水平[mIU/L]/22.5]。小鼠脱臼处死,迅速分离肝脏,称重并计算出肝指数[肝指数=肝重(g)/空腹体重(g)*100%]。留取肝左叶,部分固定于10%中性福尔马林溶液中,用于病理学检测；部分用OCT固定用于冰冻切片油红O染色。分离附睾脂肪垫、肠系膜脂肪组织、腹膜后的白色脂肪组织后称重,并计算出脂肪指数[脂肪指数=脂肪重(g)/空腹体重(g)*100%]。结果：1、小鼠一般情况：接受高脂饮食2周后,模型组小鼠体重迅速超过了正常对照组。到实验结束时,相对正常对照组,模型组体重增加了41.6%。野黄芩苷到第4周时即起到了显著的抑制作用。其他指标,如：肝重、脂肪重、腹围、Lee’s指数、脂肪指数及肝指数也发生了相应改变,野黄芩苷防治了这些变化,有效的减轻了脂肪重、肝重和脂肪指数,但是对肝指数影响较小2、小鼠脂代谢及肝功能：高脂饮食诱导模型组小鼠出现了明显的高脂血症和肝功能损害,而野黄芩苷的摄入可以降低血清血脂水平和保护肝功能,但是对高甘油三酯血症无效。3、小鼠空腹血糖及胰岛素抵抗：长期的高脂饮食诱导小鼠空腹血糖升高、高胰岛素血症、HOMA-IR(?)旨数升高、糖耐量、胰岛素耐量减退。长期的野黄芩苷干预可以减轻这一状况,缓解胰岛素抵抗。4、小鼠血清炎症：高脂饮食使得模型组小鼠则显现出了显著的炎症状态,而野黄芩苷的干预降低了血清炎症因子显现出较强的抗炎效果。5、小鼠肝脏病理改变：持续高脂饮食使得小鼠肝脏出现了明显的脂肪肝：肝细胞明显增大,脂质沉积,伴有广泛性炎症和坏死。汇管区结构模糊。野黄芩苷干预后细胞排列整齐、形态完整、细胞核及核仁结构清晰；肝索清晰可见；汇管区结构完整、无塌陷。油红O同样支持上诉结果。结论：1、野黄芩苷可抑制体重增长、降低器官指数、降低Lee’s指数；2、野黄芩苷可显著改善小鼠的脂代谢紊乱(但对甘油三酯影响不大),并具有明确的护肝作用；3、野黄芩苷可显著降低血清炎症因子,提高机体抗炎能力；4、野黄芩苷明显地降低空腹血糖、胰岛素水平、胰岛素抵抗,提高了机体胰岛素敏感性,改善了小鼠的葡萄糖耐受能力。5、野黄芩苷能抑制脂质的异位沉积,减轻了脂毒性对肝脏损伤第二章野黄芩苷对代谢综合征小鼠的保护机制目的：从降脂、抗炎、改善胰岛素抵抗方面,探讨野黄芩苷防治代谢综合征的分子机制方法：动物模型及分组同第一部分。采用Real-time PCR法检测野黄芩苷对脂质代谢通路相关靶点的影响,包括：脂质的从头合成途径、PPARγ介导的脂质合成途径、PPARα介导的脂肪酸氧化代谢以及甘油三酯的合成。运用VWestern Blotting检测小鼠肝脏中炎症通路(MAPKs、NF-κB)、胰岛素信号通路(IRS1-PI3K-AKT)及AMPK相关信号转导的改变。结果：1、野黄芩苷改善了小鼠肝脏的脂代谢(1)各组小鼠从头合成途径的比较：高脂饮食的诱导使小鼠肝脏内SREBP-1c、 FAS显著上调,达到了正常对照组的2.13倍及3.26倍,野黄芩苷抑制了二者的高表达,降低了脂质的从头合成。(2) PPARγ介导的脂质合成途径：高脂饮食使PPARγ介导的脂质合成途径(包括AP2)增高。给予野黄芩苷干预后,PPARγ与AP2的表达基本上回到了正常水平,说明野黄芩苷可以下调PPARγ的表达影响脂质的合成。(3) PPARα介导的脂肪酸氧化代谢：高脂饮食降低了模型组小鼠肝内PPARα和CPT-1a的表达,肝脏脂质氧化代谢受阻。野黄芩苷改变了相关靶点的变化,增加脂质氧化发挥降脂作用。(4)甘油三酯合成的相关靶点：模型组小鼠肝脏内的SCD-1显著上调,而mGPAT则变化不大。野黄芩苷的防治并未降低小鼠肝内的SCD-1表达水平。2、野黄芩苷抑制了小鼠肝脏炎症信号传导通路高脂饮食明显活化了炎症信号蛋白的上调(MAPKs,包括P-ERK、P-JNK、P-P38),继而活化了P-P65,激活核内炎症基因。野黄芩苷能够下调P-ERK、P-JNK、P-P65起到抑制作用,但对P-P38没有作用。3、野黄芩苷增强了小鼠肝脏胰岛素信号传导通路高脂饮食降低了肝脏P-IRS1、P-AKT而升高了P-GSK3β的表达。野黄芩苷逆转了上诉改变,增加了胰岛素敏感性。4、野黄芩苷活化了对小鼠肝脏AMPK信号通路高脂饮食抑制了肝脏P-AMPK α、P-ACC及T-ACC的蛋白丰度。野黄芩苷能够增加这些蛋白分子的活性,活化AMPK信号通路。结论：1、野黄芩苷可以抑制SREBP-1c及FAS,进而抑制脂质的从头合成途径；下调PPARY与AP2,减少脂质合成；提高PPARα、CPT-1a的表达,增加脂质氧化；对SCD-1及mGPAT无影响,故不能降低甘油三酯血症。2、野黄芩苷抑制MAPKs通路(主要是通过失活P-ERK、P-JNK)及NF-K B而降低炎症通路。3、通过激活胰岛素信号传导通路(IRS1-PI3K-AKT)而增加胰岛素敏感性。4、AMPK与脂代谢、炎症通路(如MAPKs、NF-κB)、胰岛素信号通路密切相关,而野黄芩苷可以激活AMPK,推测野黄芩苷对代谢综合征的防治可能与AMPK的激活相关。第三章野黄芩苷对高糖刺激下AMPKα2-/-/小鼠肝细胞的调控机制目的：通过体外细胞实验证实动物水平的分子机制,运用AMPKα2-/-小鼠肝细胞再次验证野黄芩苷的作用靶点方法：消化法体外培养野生型和AMPKα2-/-肝细胞,用高糖刺激野黄芩苷干预。根据细胞不同及药物干预分为：野生组(WT)、野生干预组(WT+SC)、敲除组(KO)、敲除干预组(KO+SC)。在上诉基础上根据葡萄糖浓度各自分为2组：低糖组(5mM)及高糖组(25mM),共计8组。提前半小时给予野黄芩苷(80uM)干预,随后低糖或高糖刺激2小时。Western Blotting检测细胞炎症通路(MAPKs、NF-κB)、胰岛素通路(PI3K-AKT-GSK3β及AMPK相关信号转导的改变。结果：1、野黄芩苷对高糖刺激下肝细胞AMPK信号的影响在野生型肝细胞中,高糖刺激后,P-AMPK α丰度下降,野黄芩苷的干预使得其几乎恢复到J下常水平。在AMPK α2-/-肝细胞中,有无野黄芩苷的干预变化不大。同动物实验一样,AMPK的下游靶蛋白ACC在各组间均未见差异性。2、野黄芩苷对高糖刺激下肝细胞炎症信号的影响高糖刺激下,野生型小鼠肝细胞炎症通路(MAPKs、NF-κB)被激活。野黄芩苷抑制了MAPKs通路(主要下调了P-ERK、P-P38)从而降低了P-P65的表达。在AMPK α2-/肝细胞中,野黄芩苷不能引起MAPKs、NF-κB通路的任何改变,提示了野黄芩苷对炎症通路的调控是依赖AMPK α2的激活而实现的。3、野黄芩苷对高糖刺激下肝细胞胰岛素信号的影响高糖刺激下,野生型小鼠肝细胞胰岛素信号通路未见改变。在AMPK α2-/-肝细胞中,同样未见信号蛋白改变,推测可能与刺激时间多长或蛋白磷酸化较快有关。结论：野黄芩苷可以抑制高糖诱导的野生型肝细胞炎症通路,但是这一效应是依赖AMPKα2的激活而实现的。高糖及野黄芩苷均不能引起野生型或AMPKα2-/-肝细胞胰岛素信号蛋白的改变,可能与刺激时间多长或蛋白磷酸化较快有关。