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目的:评价八宝丹治疗肝硬化轻微肝性脑病(Minimal Hepatic Encephalopathy,MHE)的临床疗效,探讨其抗炎作用机制并筛选有效活性成分,希冀为临床治疗MHE供一种新思路。方法:1.八宝丹对MHE患者的治疗作用评价(临床试验):采用随机对照研究设计,纳入并观察湿热蕴结型肝硬化MHE患者共62例,随机分为乳果糖对照组31例,八宝丹联合乳果糖治疗组31例,两组治疗周期均为8周,检测乳果糖对照组和八宝丹联合乳果糖治疗组的神经认知功能、血氨、血清炎症因子、肝功能、凝血功能和中医证候疗效等指标。2.八宝丹通过调控TLR4信号通路抑制炎症(体外/内实验):(1)原代细胞分离培养:分离培养大鼠原代骨髓来源巨噬细胞(Bone marrow derived macrophages,BMDMs)/腹腔来源巨噬细胞(Peritoneal macrophages,PMs)和小鼠BMDM/PM细胞/原代小胶质细胞/原代星形胶质细胞。(2)八宝丹通过调控TLR4信号通路抑制炎症药效学评价研究:八宝丹(5ul/ml)预处理原代巨噬细胞及胶质细胞,30min后予LPS(100ng/ml)刺激,2h后RT-QPCR法检测IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA,4h后ELISA法检测细胞上清IL-1β、IL-6和TNF-α,12h后Griess法检测细胞上清NO。(3)八宝丹通过调控TLR4信号通路抑制炎症药效梯度研究:不同浓度八宝丹(5ul/ml、2.5ul/ml、1.25ul/ml和0.625ul/ml)预处理原代巨噬细胞及胶质细胞,30min后予LPS(100ng/ml)刺激,2h后RT-QPCR法检测IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA,4h后ELISA法检测细胞上清IL-1β、IL-6和TNF-α,12h后Griess法检测细胞上清NO。(4)八宝丹调控TLR4信号通路研究:八宝丹(5ul/ml)预处理小鼠原代巨噬细胞及胶质细胞,30min后予LPS(100ng/ml)刺激,0、20、40、60、90和120min后Western blot法检测p-P65/P65、p-ERK/ERK、p-JNK/JNK和p-P38/P38变化情况。(5)八宝丹对LPS诱导的小鼠内毒素休克/血症的防治作用评价:八宝丹(200mg/kg)灌胃预处理小鼠,2h后予LPS(50mg/kg)腹腔注射,4h后检测小鼠血清炎症因子、肝功能、肝脑肺炎症因子mRNA以及组织病理学改变。3.八宝丹主要活性成分筛选:原人参二醇类皂苷、原人参三醇类皂苷、齐墩果烷类皂苷和麝香酮分别预处理小鼠原代BMDM细胞,30min后予LPS(100ng/ml)刺激,4h后予尼日利亚菌素(2.5u M)刺激,1h后ELISA法检测IL-1β、IL-6和TNF-α。结果:1.八宝丹对MHE患者的治疗作用评价:比较单独使用乳果糖,八宝丹联合乳果糖有效改善湿热蕴结型MHE患者的神经认知功能、血氨及肝功能(P<0.05),显著改善其血清炎症及中医证候(P<0.001)。2.八宝丹通过调控TLR4信号通路抑制炎症:(1)八宝丹通过调控TLR4信号通路抑制大鼠BMDM/PM细胞活化:八宝丹明显抑制LPS诱导大鼠BMDM/PM细胞IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表达及细胞上清中TNF-α蛋白和NO表达(P<0.001),且具有显著的剂量依赖性(P<0.001)。(2)八宝丹通过调控TLR4信号通路抑制小鼠BMDM/PM/原代小胶质/星形胶质细胞活化:八宝丹明显抑制LPS诱导的小鼠BMDM/PM/小胶质/星形胶质细胞IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表达及细胞上清IL-6、TNF-α和NO表达(P<0.001),且具有显著的剂量依赖性(P<0.001);八宝丹明显抑制LPS诱导的小鼠BMDM/PM/小胶质/星形胶质细胞TLR4下游信号分子蛋白P65、ERK、JNK和P38的磷酸化改变。(3)八宝丹可以防治LPS诱导的小鼠内毒素休克/血症:八宝丹能够明显降低LPS诱导的内毒素休克小鼠的死亡率(P<0.001);明显改善LPS诱导的内毒素血症小鼠的肝功能(P<0.01),抑制血清炎症因子表达(P<0.05)、肝肺脑炎症基因表达及肝肺组织损伤。3.八宝丹主要活性成分筛选:麝香酮、齐墩果酸、原人参二醇、20(s)人参皂苷Rh2、原人参三醇和人参皂苷CK均能明显抑制炎症(P<0.001)。结论:1.八宝丹可以改善湿热蕴结型轻微肝性脑病患者的神经认知功能、血氨、肝功能及血清炎症,有效缓解临床症状,为治疗轻微肝性脑病供一种新思路;2.八宝丹可以抑制LPS诱导的多种原代细胞活化(大鼠BMDM/PM细胞和小鼠BMDM/PM细胞/原代小胶质细胞/原代星形胶质细胞),并可以防治LPS诱导的小鼠内毒素休克/血症,其机制可能与调控TLR4信号通路相关;3.八宝丹中主要的抗炎活性成分可能是麝香酮、原人参二醇、20(s)人参皂苷Rh2、原人参三醇、人参皂苷CK和齐墩果酸。