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胃癌是常见的严重威胁人类生命健康的恶性疾病之一,据统计占我国消化道恶性肿瘤的第一位,全身肿瘤的第三位,并有继续上升的趋势。手术切除为其主要治疗手段,但术后复发及转移率较高。根治性手术治疗进展期胃癌5年生存率为40%,患者主要死于复发和转移,而淋巴转移是其最主要的转移方式。侵袭和转移是恶性肿瘤重要的生物学特征,是导致临床上绝大多数肿瘤患者死亡的主要因素。侵袭和转移是肿瘤生长发展过程中密不可分的相关过程,侵袭行为是肿瘤转移的内在因素。如何穿越生物学屏障是肿瘤细胞侵袭和转移动态过程的关键步骤。在此过程中,癌细胞与基底膜或细胞外基质粘附,然后释放和激活多种蛋白水解酶降解基底膜和细胞外基质,在趋化因子、自分泌以及旁分泌生长因子等作用下迁移到达靶组织,克隆增殖从而形成转移灶。肿瘤细胞可以直接侵入淋巴管,原有及新生的淋巴管均将成为肿瘤细胞淋巴转移的通道。肿瘤由原发部位脱落而发生转移,也可以通过血液循环到达淋巴结门并在淋巴结中被捕获,侵入血管中细胞多,淋巴结受累机率则高。但是后者发生的机率远较前者小。由此可见,对于胃癌来说,其表达粘附、侵袭相关因子如基质金属蛋白酶(matrix metal proteinases, MMPs)的水平、微血管、微淋巴管密度将直接影响其淋巴转移的发生。右旋柠烯(d-limonene)是中药桔皮中提纯的单体成份,属于天然单萜烯类化合物。其学名为1-甲基-4-异丙基环己烯,分子式C10H16,分子量136.23。右旋柠烯在桔皮精油中的含量超过90%,纯度高达97%。它具有防治化学诱导的啮齿类动物乳腺癌、皮肤癌、肝癌、肺癌、胃癌、结肠癌和胰腺癌等作用,其低毒、广谱和食用性特征使其受到国内外研究者的广泛关注。右旋柠烯防治癌症的机制理论上有如下观点:初期的预防作用是诱导致癌物代谢的酶类表达,使致癌物解毒;初期后的预防作用是由于诱导了癌症细胞凋亡、细胞再分化和/或抑制了细胞生长调节蛋白转移酶的异丙基化等多种机制发挥预防及治疗作用。但是对其在肿瘤转移方面尤其是对淋巴转移的作用和机制的相关研究未见报道。近来,对肿瘤淋巴转移的研究倍受重视,多种淋巴管内皮细胞特异性标记物<WP=6>如血管内皮生长因子受体3(vascular endothelial growth factor receptor 3, VRGFR-3)、LYVE-1和Podoplanin等的发现使淋巴管与血管的区分成为可能。但是迄今人们对肿瘤淋巴结转移的机制了解甚少。目前认为,血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor C, VEGF-C)是较特异的淋巴管内皮生长因子,属于血管内皮生长因子家族,它主要通过激活其特异性表达于淋巴管内皮细胞的受体VEGFR-3,继而经由MEK/ERK和PI3-激酶/Akt途径引起淋巴管内皮细胞增生和淋巴管发生。由于淋巴管缺乏紧密连接和连续的基底膜,肿瘤细胞容易从淋巴管内皮细胞间隙进入淋巴管。肿瘤细胞由于产生较高水平的VEGF-C,通过与其受体的作用,促进肿瘤淋巴管形成,淋巴管数目的增多增加了肿瘤细胞接触和进入淋巴管的机会,从而促进淋巴结的转移。本实验将检测多种人胃癌细胞和手术切除胃癌标本中VEGF-C表达水平,分析其与肿瘤生物学行为和临床病理特征的关系,并在此基础上,通过体内裸小鼠原位移植模型和体外粘附、侵袭实验评价右旋柠烯对胃癌转移能力的抑制作用,在细胞和分子水平探讨其作用机理,并为该药的临床应用提供理论依据。第一部分 胃癌细胞VEGF-C表达水平与粘附、侵袭能力的关系目的:观察不同胃癌细胞株VEGF-C蛋白表达与胃癌细胞体外粘附、侵袭能力的关系,探讨VEGF-C对胃癌细胞转移潜能的作用。方法:三种人胃腺癌细胞BGC-823、SGC-7901、MKN-45,常规RPMI-1640培养液于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养,取处于对数生长期的细胞备用。Western-blot法检测肿瘤细胞裂解液中VEGF-C蛋白表达水平;以纤维粘连蛋白和层粘连蛋白为作用对象,检测不同胃癌细胞与细胞外基质粘附作用;利用Transwell小室,以Matrigel和纤维粘连蛋白构建重组基底膜,检测胃癌细胞侵袭人工基底膜能力;针对VEGF-C基因编码区设计合成反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide, ASODN),通过脂质体介导对VEGF-C高表达胃癌细胞株进行转染;蛋白印迹检测反义寡核苷酸封阻后VEGF-C和基质金属蛋白酶2(matrix metal proteinase 2, MMP-2)蛋白表达;体外粘附实验和侵袭实验检测胃癌细胞肿瘤生物学行为的改变。结果:蛋白印迹结果显示,三种细胞株BGC-823、SGC-7901、MKN-45 裂解液VEGF-C蛋白表达积分光密度分别为21.5±0.8、28.6±0.5和17.2±0.7,以SGC-7901表达水平最高;对细胞外基质纤维粘连蛋白和层粘连蛋白的粘附率分别为89.2%、96.6%、81.3%和90.8%、98.5%、82.7%;24h侵袭实验表明,SGC-7901细胞具有较强的体外侵袭能力(侵袭细胞数分别为114.5±20.9、186.3±14.2和<WP=7>96.1±15.7)。相关分析显示,VEGF-C表达与粘附、侵袭能力呈正相关。VEGF-C反义寡核苷酸封阻后,SGC-7901细胞VEGF-C表达下调(26.1±0.8/9.4±0.6),粘附、侵袭能力减弱(分别为94.5%/64.8%、96.2%/70.9%和169.8±16.2/71.1±10.5)。同时发现,转移重要相关分子MMP-2蛋白表达下调(24.3±0.6/12.8±0.3)。结论:VEGF-C表达与胃癌细胞体外粘附、侵袭能?