论文部分内容阅读
本研究旨在细菌通过监控某些信号分子的浓度可感知其群体大小，进而调节整个群体的行为，使其能与多细胞生物一样，行使单个细胞无法完成的功能，这种依赖细胞密度的细胞信息交流现象被称为细菌群体感知系统(quorumsensing，简称QS)。而抗细菌群体感知系统被称为细菌群感淬灭(quorumquenching)。细菌的多种重要的生理生化功能及其表型特征都与QS系统介导的信号转导有关。由于QS系统参与了多种病原细菌致病性的产生，因此在发展抗细菌感染新疗法的研究中，该系统被认为是一个重要的作用靶点。N-乙酰高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserinelactones，AHLs)，又称自诱导物(autoinducers，AIs)，是一类调控大多数革兰氏阴性菌QS系统的信号分子。目前已在多种细菌和真核生物中发现了可降解AHLs信号分子的酶，如N-乙酰高丝氨酸内酯酶(AHL-lactonases)，又称自诱导物失活剂(autoinducerinactivation，AiiAs)，这类酶极具医疗应用潜力，分离和发现新的QS系统抑制生物和酶十分有利于新型抗生素和生物防控制剂的开发。
本研究建立了一种QS系统抑制活性菌的平板筛选模型，该模型以根癌农杆菌R10和WCF47为指示菌，通过观察指示菌WCF47对待测菌与AHLs(R10粗提物)共培养物的颜色反应判断待测菌有无AHLs降解活性，具有简便、经济、直观的特点。
目前已有报道的QS系统抑制生物都分离自土壤、植物等陆地生长环境，而群体感应现象最初是在海洋发光细菌Vibrioficheri中首次发现的，但至今鲜见海洋细菌QS抑制现象的报道。本研究分别从海南陵水县海域和深圳大亚湾海域的不同采样点采集海水样品，有限稀释法涂布平板分离细菌，通过三次划线纯化分离到的菌株，并应用已建立的QS抑制生物检测模型筛选其中具有AiiA活性的海洋细菌。其中，菌株Y2具有明显和稳定的AHLs降解活性。对Y2进行形态学、生理生化鉴定及16srDNA序列分析，鉴定该海洋细菌应归类于真细菌目、芽孢杆菌科(Bacillaceae)、芽孢杆菌属(Bacillus)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)，暂命名为BacilluscereusY2。
本研究用限制性内切酶Sau3AI消化BacilluscereusY2菌株的基因组DNA，并与经BamHI酶切的pBACe3.6质粒连接，构建了BacilluscereusY2的基因组文库。根据已知aiiA基因的保守区域序列设计一对探针，对BacilluscereusY2的基因组文库进行southernblotting分析，结果显示该海洋细菌的基因组文库中存在aiiA基因的同源保守片段。进一步利用与aiiA基因5和3末端互补的简并引物进行PCR扩增，扩增出海洋细菌Y2内编码N-乙酰高丝氨酸内酯酶的基因Y2-aiiA的全长序列，并将其克隆入pBV220质粒，获得重组质粒pBV220-Y2-aiiA。通过同源比对发现Y2-aiiA为一新基因，但与GenBank数据库中其它同类基因有高度的同源性；以重组质粒pBV220-Y2-aiiA为PCR模板，将Y2-aiiA基因克隆入原核表达质粒pQE40，获得重组质粒pQE40-Y2-aiiA，将其转化进大肠杆菌M15，经IPTG诱导Y2-AiiA的重组表达，并利用镍离子螯合层析技术对带有N-端6×His标签的Y2-AiiA蛋白进行了纯化，得到一分子量约为28kDa并具有AiiA活性的蛋白表达产物。
为深入了解该来源于海洋的N-乙酰高丝氨酸内酯酶的结构和功能特点，利用同源建模的方法建立了Y2-AiiA蛋白的3D结构，发现该蛋白由5个α-螺旋和12个β-折叠构成，属αβ/βα型蛋白超家族；β-折叠形成该蛋白内部排列紧密的核心，α-螺旋包围着由β-折叠形成的蛋白核心，构成蛋白外部可溶性的片层结构。在此三维结构的基础上，进行Y2-AiiA酶蛋白与AHL底物的Docking分子对接模拟和酶活性位点的预测，多次计算确定的Docking模型提示，Asp17、Ser19和Ser20这三个保守的氨基酸残基在Y2-AiiA蛋白的三维结构中占据了催化部位，Tyr194对维持Y2-AiiA的三维结构起重要作用，Ser19和Ser20与AHL底物分子之间的作用距离十分有利于酶对AHL分子结构中高丝氨酸内酯环上的骨架或羰基氧原子的攻击，或产生稳定的酶-底物复合物。为验证以上结构和功能推测，对Y2-AiiA中的的Asp17、Ser19和Ser20这三个保守氨基酸残基进行了点突变，分别将Asp17突变为Asn，将Ser19和Ser20突变为Ala，并进行了野生型和3个突变型Y2-AiiA蛋白的重组表达和纯化。对比3种突变型Y2-AiiA蛋白与野生型Y2-AiiA蛋白降解AHL分子的活力，结果发现，在大肠杆菌中表达的野生型Y2-AiiA蛋白有较高的AHL降解活性，而Ser19突变导致了酶活力的显著下降，Ser20突变对酶活力稍有影响，而Asp17突变对酶活力无明显影响，从而最终确定Ser19、Ser20为海洋N-乙酰高丝氨酸内酯酶Y2-AiiA的关键催化残基。基于以上实验数据，本文对海洋N-乙酰高丝氨酸内酯酶Y2-AiiA的催化机制作出了推断，其反应为丝氨酸水解酶的催化过程。