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血管内皮抑素是一种内源性血管生成抑制因子,最初从鼠血管内皮细胞瘤培养液中分离提纯得到,能特异性抑制肿瘤血管内皮细胞增殖,对动物转移性和原发性肿瘤均有强烈抑制作用,而且反复应用无耐药性产生,对机体无明显毒副作用。因此其在恶性肿瘤的治疗中具有很好的应用前景。目前重组内皮抑素蛋白治疗肿瘤研究最主要的困难是大量制备稳定的具有生物活性的蛋白。为了获得高活性的内皮抑素进一步研究其生物功能和作用机制,在本研究中,我们探讨了内皮抑素治疗肿瘤研究的两种形式:蛋白质形式和基因形式,即利用大肠杆菌系统表达重组人内皮抑素蛋白治疗肿瘤研究和利用双歧杆菌介导的人内皮抑素基因治疗肿瘤研究。主要研究结果如下:
1.前期研究了重组人内皮抑素通过大肠杆菌包涵体产物体外重新折叠的生产工艺路线,并获得了可溶的,高纯度,高活性的重组内皮抑素。但其生产过程分离纯化和质量控制难度较大。所以本研究探讨了人内皮抑素基因在大肠杆菌中可溶性表达。用PCR方法从质粒pET9c—endostatin扩增得到人人内皮抑素基因,将其克隆到分泌型表达载体pET26b中。pET26b—endostatin转入至大肠杆菌后的诱导表达产物,经SDS—PAGE和western bot分析,携带信号肽的内皮抑素大部分并没有被分泌至细胞周质空间,其表达产物仍是不溶性的包涵体形式。
2.不同制备方法产生的重组内皮抑素的抗肿瘤活性差异很大,因此有必要建立一种可重复的能精确定量测定内皮抑素体内抗肿瘤活性的方法。本研究采用三个剂量重组人内皮抑素治疗H22荷瘤小鼠,结果显示重组人内皮抑素在H22荷瘤小鼠模型中具有显著的可重复的量效关系。从剂量回归分析算得的ED50即抑瘤率为50%时所需重组人内皮抑素剂量同样具可重复性。这使得重组人内皮抑素制剂的抗肿瘤效价可采用ED50-效价测定法定量测定,并采用3×3量反应平行线测定法检定实验的可靠性和重组人内皮抑素制剂的效价。以上研究结果最终确立七批重组人内皮抑素制剂的标示效价为6.09×105U/ampoule,其95%可信区间为5.96×105~6.22×105。该重组人内皮抑素体内抗肿瘤活性定量测定方法可用于不同重组人内皮抑素制剂效价评估。
3.为使长双歧杆菌作为介导内皮抑素基因治疗肿瘤的安全稳定的载体系统,我们将氯霉素抗性基因和来自长双歧杆菌的质粒pMB1克隆至pBV222载体中,构成一个新质粒pBV22210。同时将人内皮抑素基因克隆至pBV22210载体的6His标签下游以便于在双歧杆菌中表达的人内皮抑素可利用Ni柱纯化。结果显示电转导至双歧杆菌的pBV22210-endostatin可稳定存在,且对长双歧杆菌的生理特性无显著影响。此外,抗肿瘤活性研究结果显示含pBV22210-endostatin质粒的长双歧杆菌可显著抑制小鼠肝癌实体瘤的生长。这些结果表明这个新质粒可作为双歧杆菌介导抗癌基因治疗肿瘤的稳定载体。