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杜仲（Eucommia ulmoides oliver）在我国已有超过2000年的药用历史。现代研究证实,杜仲叶和杜仲皮中的活性物质的种类与含量相近,功效基本相同,有些时候可以用杜仲叶替代杜仲皮进行疾病治疗。本文从“具有抗氧化、抗炎、增强免疫及抗乳腺癌活性的杜仲叶多糖（Eucommia ulmoides leaf polysaccharides,EULP）极有可能具有HT-29结肠癌细胞抑制活性”的假设出发,以5月采摘杜仲叶为原料,通过Box-Behnken实验优化了超声波协同酶法提取EULP工艺参数;对优化条件下提取的粗多糖精制后,对其进行结构表征和体外HT-29结肠癌细胞抑制活性实验;同时,对该精制多糖分离纯化,研究分离后EULP组分的HT-29结肠癌细胞抑制活性及其分子结构特征;最后,从4月、6月、8月、10月采收的杜仲叶中提取粗多糖,测定其含量,并进行HT-29结肠癌细胞抑制活性实验与分子结构特征分析。本文在证实了EULP具有HT-29结肠癌细胞抑制活性的同时,还为以EULP为主要原料的防治结肠癌保健食品、药品的开发、指导种植户合理采收优质杜仲叶提供了科学理论依据。1.超声波协同酶法提取EULP工艺参数优化。以5月采摘杜仲叶为原料,考察了复合酶添加量、p H、提取温度,超声波功率、液料比和提取时间6个因素对多糖得率的影响,通过Plackett-Burman实验筛选出三个显著影响多糖得率的因素:p H、超声波功率和复合酶添加量,其重要性依次为:p H>超声波功率>复合酶添加量。通过最陡爬坡实验和Box-Behnken实验,得到超声波协同酶法提取EULP的最佳工艺条件为:复合酶添加量3.7%、p H 4.0、超声波功率100 W、提取温度45℃、液料比20:1（m L/g）和提取时间15 min。在此条件下,EULP的实际得率为4.79±0.02%,与预测值4.87%接近,且得率远高于传统水浸提法。2.EULP结构表征与HT-29结肠癌细胞抑制活性研究。用超声波协同酶法从5月杜仲叶提取粗多糖并精制,对该精制EULP进行了分子量、单糖组成和红外光谱分析,并以HT-29人结肠癌细胞为作用对象,考察了EULP对结肠癌细胞的增殖、迁移抑制与促凋亡活性。结果表明,该EULP的分子量Mw=1.8×105Da,多分散性指数Mw/Mn=1.94,其主要成分为甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖,分别占总多糖的13.52%、42.78%和20.84%,是一种β型酸性杂多糖。在体外HT-29结肠癌细胞抑制活性试验中,经高剂量组EULP（750μg/m L）作用72 h后,HT-29结肠癌细胞的增殖抑制率为37.45±0.10%,高于同时间段阳性对照组37.17±0.13%;相对迁移率为15.89±0.39%,远低于空白对照组39.37±0.50%;且在细胞凋亡分析实验中,EULP促进HT-29结肠癌细胞凋亡现象明显。3.EULP的分离与HT-29结肠癌细胞抑制活性组分筛选、结构表征。先采用DEAE-52纤维素离子交换层析对精制EULP进行分离纯化,得到三个主要纯化组分:EULP-Ⅰ、EULP-Ⅱ和EULP-Ⅲ。在结肠癌细胞增殖抑制实验中,三个组分均表现出一定的抑制活性,其中EULP-Ⅲ对结肠癌细胞的增殖抑制效果最好。再采用Sephadex G-100凝胶层析对EULP-Ⅲ进一步分离纯化,得到两个主要纯化组分:EULP-Ⅲ-a和EULP-Ⅲ-b。在结肠癌细胞增殖抑制实验中,EULP-Ⅲ-b的增殖抑制效果明显优于EULP-Ⅲ-a。对EULP-Ⅲ-b进行结构表征,结果显示EULP-Ⅲ-b的分子量Mw=3.1236×104Da,主要由盐酸氨基半乳糖、鼠李糖、盐酸氨基葡萄糖和半乳糖组成,摩尔比为0.099:0.394:0.178:0.329;与分离前的检测结果一样,半乳糖仍是EULP-Ш-b的主要组成成分。4.不同采收时期的杜仲叶提取粗多糖含量、结构特征与HT-29结肠癌细胞抑制活性变化。选取4月、6月、8月和10月采收的杜仲叶进行多糖提取,得到粗多糖EULP1、EULP2、EULP3和EULP4。研究发现,EULP1和EULP4中多糖含量比EULP2和EULP3高;EULP1、EULP2、EULP3和EULP4的分子量分别为5.837×105Da、1.341×105Da、7.992×104Da和3.724×105Da;EULP1和EULP2的主要成分是鼠李糖和半乳糖,而EULP3和EULP4的主要成分是半乳糖和阿拉伯糖,其中EULP1和EULP4中半乳糖含量最高,分别达29.1%和32.9%;四种杜仲叶粗多糖的红外光谱基本一致,都具有常见的多糖特征峰。在HT-29结肠癌细胞抑制活性实验中,加药处理72 h后,EULP1和EULP4对HT-29细胞的增殖抑制活性远高于EULP2和EULP3;抗HT-29细胞迁移活性顺序依次为:EULP1>EULP4>EULP3>EULP2。