研究背景肿瘤发生的生物学基础是细胞增殖失去调控,通常是具有生长潜能的细胞受到物理、化学、生物等各种致癌因素作用后,细胞内的原癌基因被激活,细胞获得持续增殖能力程序性凋亡功能发生障碍。肿瘤发生后,肿瘤细胞获得持续增殖的能力,肿瘤组织快速增殖,在其快速增殖过程中,由于血管的增长速度赶不上瘤体的增殖速度,瘤体内部会出现血液供应不足的情况,进而造成瘤体内部氧气供应不足,产生低氧(Hypoxia)。低氧是包括肝癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌等多种固体肿瘤的典型特征之一,是指可利用氧的减少或氧分压降至临界值以下的状态,这种状态会限制,甚至终止器官、组织和细胞的生理功能。研究发现低氧微环境使肿瘤对放疗、化疗和手术治疗的疗效明显下降。其可能的机制是氧气被激发产生自由基,而氧自由基可以杀伤靶细胞,从而达到杀死肿瘤细胞的目的。但是,肿瘤低氧区的细胞由于缺乏氧气而产生较少的自由基,往往会对治疗产生抵抗。与常氧区比起来,低氧区的肿瘤细胞可以在放疗后存活并继续增殖。随着研究的深入,肿瘤低氧对其自身的影响远远不只是对放疗的抵抗作用,而遍及细胞的各个领域。机体通过细胞内Heme、氧化还原状态、线粒体的ROS感受外界氧信号变化,通过NO、CO等气体信号分子、KATP等离子通道、细胞内游离钙、环核苷酸、PKC、MAPK等应激相关信号通路,调节线粒体编码的部分呼吸酶亚基与核编码的亚基的协同表达,改变能量的产生和利用。已知间歇性低氧预适应可增强热休克蛋白类及抗氧化酶系表达,调控线粒体中的基因表达,抑制细胞内钙超载、影响细胞核膜的钙转运,提高葡萄糖转运能力,激活低氧相关信号转导通路。热休克蛋白(Heat shock protein, Hsps)是一类蛋白质超家族,Hsp90是其中最重要的一种。Hsp90在生物进化过程中高度保守,在细胞内有着举足轻重的作用,当前研究发现的其作用底物已超过200种蛋白。同样越来越多的研究发现肿瘤的发生与治疗亦涉及到机体的各个方面,但当前治疗药物大多是针对单一信号通路,治疗效果不理想,而联合用药导致治疗复杂化及更多的副作用,因此作用于多个信号通路的药物具有良好的应用前景。Hsp90就是多个信号通路的分子靶点,亦有多项研究发现其在多种肿瘤中呈高表达,是肿瘤治疗研究中潜在重要靶点。自从第一个具有抗肿瘤活性的Hsp90抑制剂格尔德霉素被发现以来,美国国家肿瘤中心(Bethesda,MD,USA)研究针对Hsp90靶点治疗药物已经进行了20多年。到目前为止已经有多种具有抗肿瘤活性的Hsp90抑制剂被发现,其中有的具有良好的效果而进入了Ⅰ期或Ⅱ期临床试验,如：格尔德霉素(geldanamycin)、17-AAG (17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin)-.17-DMAG (17- Dimethylaminoethylamino-17-demethoxygeldanamycin)等。尤其格尔德霉素衍生物17-DMAG因其良好抗肿瘤作用、更好的水溶性和抗肿瘤活性,成成为一个具有良好的应用前景的抗肿瘤药物。细胞周期蛋白cyclinB1就是Hsp90众多的底物蛋白之一,是细胞G2/M期的关键蛋白,控制着细胞由G2期进入M期。在正常哺乳动物细胞中,细胞周期进程中存在着避免细胞DNA和蛋白复制过程出现错误的G1期和G2期两个重要的细胞周期检查点,但在肿瘤细胞中普遍存在G1期检查点缺陷,进而在肿瘤细胞分裂进程中,肿瘤细胞趋向依赖G2期细胞周期检查点去避免肿瘤细胞的致死性分裂,肿瘤细胞G2期细胞周期检查点成为了肿瘤靶向治疗当中的诱人靶点。cyclinB1作为G2/M期的关键蛋白,其在肿瘤的治疗、预后等都起着很重要的作用。当前已有多种研究证实,cyclinB1在胃癌、食管癌等多种肿瘤中异常表达。亦有研究证实cyclinB1的表达高低对肿瘤的治疗有明显的相关性,研究结果显示,cyclinB1的高表达有利于肿瘤的治疗,尽管其具体机制尚未明确,但其与肿瘤的发生发展、诊断、治疗及预后表现出的密切联系日益受到关注。cyclinB1是Hsp90的作用底物之一,二者之间的具体作用关系尚未完全明确,但确定的是二者之间存在者千丝万缕的关系。本课题组前期研究结果显示Hsp90抑制剂17-DMAG可以增加cyclinB1的表达,亦有研究证实17-DMAG通过调节cdc2蛋白诱导细胞G2/M期阻滞,而调节cdc2的直接结果就是诱导cyclinB1蓄积进而导致周期阻滞,即基本明确的是17-DMAG诱导cyclinB1蓄积导致细胞G2/M期阻滞,进而诱导细胞凋亡。目前,有许多研究显示,低氧可以降低肿瘤对药物的敏感性,且发现低氧可诱导肿瘤细胞周期分布发生改变,导致细胞G2/M期减少。G2/M期减少意味着G2/M期蛋白cyclinB1的表达会发生变化,但在低氧状态下cyclinB1的表达会发生何种变化及其具体的机制均有待进一步探讨研究。由此,本研究通过物理低氧方法在体外建立肝癌细胞低氧模型,应用Hsp90抑制剂17-DMAG,观察描述与常氧相比,低氧下17-DMAG对肝癌细胞的作用,以及cyclinB 1的表达变化,探讨其变化与17-DMAG对肝癌细胞作用变化的相关关系及相应的作用机制。目的：1.建立肝癌细胞株低氧应激模型,研究在常氧和低氧培养状态下,不同肝癌细胞株的增殖情况及其对细胞周期的影响。2.研究在常氧或低氧状态下不同浓度的Hsp90抑制剂17-DMAG对肝癌细胞株的生长抑制情况、对细胞周期的影响。3.研究低氧和17-DMAG对细胞周期蛋白cyclinB1表达的影响,CyclinB1是否参与低氧降低肿瘤细胞对17-DMAG的敏感性及其具体机制。4.研究裸鼠荷瘤瘤体内低氧区域cyclinB1的表达变化。方法：1.建立低氧应激模型：将HepG2和Huh7细胞分别于1%02的低氧下培养不同时间(Oh、24、48、72h), CCK-8比色法检测各个时间点细胞增殖情况。Western-blot检测细胞全蛋白HIF-1α,观察低氧效应。2. HepG2和Huh7细胞分别于低氧下培养不同时间(0h、6h、12h、24h,48h),流式细胞术检测不同时间的低氧对细胞周期的影响。3.HepG2和Huh7细胞于常氧或低氧培养状态下用不同浓度(0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、l0μM)的Hsp90抑制剂17-DMAG分别处理24h和48h,用CCK-8比色法检测细胞存活情况,流式细胞术检测常氧或低氧状态下不同浓度(0、0.01、0.05、0.1、0.5、 1μM)17-DMAG对细胞周期的影响,Western-blot检测相关周期蛋白表达情况。4.利用质粒转染技术建立cyclinB 1-mCherry稳定转染细胞株,激光共聚焦显微镜连续观察24h内细胞内cyclinB1蛋白的合成情况及其在细胞内的定位。5.利用Real-time PCR技术检测肝癌细胞株HepG2和Huh7细胞内cyclinB1的RNA转录情况,利用免疫共沉淀(Co-IP)技术检测cyclinB1被泛素蛋白标记情况。6.利用siRNA技术干扰肝癌细胞株HepG2的cyclinB1表达,将细胞分为对照组(NC组)和siRNA干扰组,于常氧培养并用不同浓度17-DMAG处理24h,CCK-8比色法检测细胞存活情况。7.肝癌细胞株HepG2进行裸鼠荷瘤实验,观察17-DMAG对荷瘤瘤体生长的影响。通过免疫组化技术区别瘤体内低氧与常氧区,并检测相应区域cyclinB1的表达情况。结果：1.1%的低氧处理后,细胞内HIF-la表达明显增多,达到预期低氧效果。且低氧明显促进肝癌细胞株HepG2和Huh7增殖,不同浓度的17-DMAG处理肝癌细胞株HepG2和Huh7　24h后,与常氧组相比,低氧组细胞增殖毒性较低,细胞G2/M期阻滞程度较低,cyclinB1表达水平低。2.低氧条件下培养肝癌细胞株HepG2和Huh7不同的时间后,细胞周期出现G1/S期增多,G2/M期减少。低氧时间越久,G1/S期增多越明显。低氧可以减轻17-DMAG诱导肝癌细胞株HepG2和Huh7 G2/M期阻滞。在常氧或低氧下17-DMAG均可诱导肝癌细胞株HepG2和Huh7凋亡。3.17-DMAG通过调节cdc2蛋白诱导细胞周期蛋白cyclinB1蓄积。与常氧组相比,低氧降低cyclinB1的表达,并增加经过泛素-蛋白酶体途径的降解。siRNA干扰cyclinB1的表达后,与正常对照组相比,17-DMAG对细胞的抑制率下降。4.17-DMAG能明显抑制裸鼠荷瘤瘤体的生长,瘤体内HIF-la表达高的区域,cyclinB1低表达。结论：1.在低氧应激模型建立过程中,研究结果显示1%浓度的02可以明显促进肝癌细胞株HepG2和Huh7增殖,并且诱导肝癌细胞株HepG2和Huh7细胞周期变化,导致G1/S期增多,G2/M期减少。2.不同浓度的17-DMAG在常氧或低氧状态下处理肝癌细胞株HepG2和Huh7,与常氧状态下比较,低氧可以降低肝癌细胞株G2/M的阻滞程度,也能够降低肝癌细胞株对17-DMAG的敏感性。3.在低氧状态下,肝癌细胞能够通过降低cylinB1的转录水平,增加cyclinB1经过蛋白酶体途径降解速率减少17-DMAG诱导的cyclinB1蓄积,进而降低肝癌细胞对17-DMAG的敏感性。4.裸鼠荷瘤结果显示,17-DMAG能明显缩小瘤体体积,瘤体内存在明显的低氧区域,且在低氧区域cyclinB1转录水平降低。综上可得：低氧能够通过降低cyclinB1的表达和促进降解来降低肝癌细胞对Hsp90抑制剂17-DMAG的敏感性。