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AT14A是拟南芥中一个与动物整合素具有部分同源序列的功能未知的蛋白。整合素是动物细胞质膜上介导胞外基质—质膜—细胞骨架连续体的重要中间分子,调控了细胞间的相互粘附和细胞内外的信号转导。植物细胞与动物细胞的差别之一在于表面结构的不同。植物细胞表面的由多糖和少量的蛋白等构成的复杂网状结构——细胞壁与质膜、细胞骨架也构成了一个信号转导连续体系。AT14A蛋白氨基酸序列中有一段与整合素相似的保守序列,提示其可能作为细胞壁—质膜—细胞骨架连续体的中间成员参与了细胞内外的信号转导过程。本研究以拟南芥为试验材料,对AT14A蛋白与细胞壁组成之间的关系进行了研究,主要结果如下:
1.采用农杆菌介导的转基因方法,将AT14A-GFP融合基因转至拟南芥野生型植株以及悬浮细胞中,获得了相应的转基因株系和悬浮细胞系。完整植物材料体系的建立为研究AT14A的功能创造了条件。在转AT14A-GFP融合基因植株叶片下表皮细胞和气孔保卫细胞膜部位出现了GFP的特异绿色荧光,验证了AT14A是一个膜蛋白。
2.对三种AT15A相关基因型拟南芥细胞壁多糖组分的测定结果表明,过表达株系AT14A细胞壁的纤维素含量显著高于野生型和突变体;与野生型和过表达株系相比,缺失型突变体at14a细胞壁的果胶类物质含量显著增加;而过表达和突变体细胞壁葡聚糖的含量均比野生型有显著增加。以上结果表明,无论AT14A的过表达还是缺失,都会改变拟南芥植株细胞壁多糖组分的构成。
3.改进了拟南芥植株细胞壁蛋白的提纯方法。对改进前后壁蛋白的提取效果比较分析表明,增加C18过柱和丙酮沉淀步骤,有助于细胞壁蛋白的纯化和减少损耗,并能有效提高电泳质量和重复率。
4.对三种AT14A相关基因型拟南芥细胞壁蛋白双向电泳结果比较分析获得的16个差异蛋白点进行了MALDI-TOF-MS分析和数据库检索鉴定,共有11个目的蛋白质得到了鉴定,在9个具有确定功能的蛋白中有2个蛋白与细胞壁组成直接相关——木葡聚糖水解酶(XTH7)和ADP核糖基化因子(ARF)型小G蛋白的鸟苷交换因子(EMB30)。
5.通过酵母双杂交的方法对与AT14A互作的蛋白进行了筛选,以AT14A-N端胞内序列为诱饵,在cDNA表达文库中筛选得到了一个可能与细胞壁相关的蛋白——TSK相关蛋白1(TSA1);而以AT14A-C端序列为诱饵筛选得到的4个与细胞壁代谢相关或参与抗逆过程相关的蛋白,其中的α-木糖甘酶更直接参与了木聚糖和木葡聚糖的代谢过程。
总之,AT14A与细胞壁的组成有密切的关系,其很可能作为细胞壁—质膜—细胞骨架连续体的中间分子介导了细胞内外的信号转导过程。