背景颅骨缺损是神经外科常见的疾病,对于缺损范围大于3cm的成年患者通常要求行颅骨修补治疗,但是对于儿童而言,由于其颅骨和大脑正在发育,手术后是否对其发育有限制作用,目前还没有明确的说法,从而导致临床医生在治疗儿童颅骨缺损时心存疑虑。研究目的本课题拟在动物模型上探明以金属修补材料(钛网)修补未成熟颅骨缺损是否对该未成熟颅骨和大脑发育产生限制性,并进一步探索儿童颅骨的发育机理,为临床儿童颅骨缺损手术治疗提供依据。研究内容(1)选用1个月龄的小尾寒羊(幼羊),分为实验组(A),实验组(B)和对照组(C)。A组又分为2组,其中A1组以矢状缝为中线,在该线一侧做颅骨钛网固定,另一侧钉以游离钛钉;A2组则跨颅骨矢状缝对称固定钛网,在其前方钉以游离钛钉;B组则在颅骨上制作大小4 cm×4 cm的颅骨缺损模型后,应用钛网修补缺损处。C组不接受钛网固定,也不制作成颅骨缺损和接受钛网修补。每月连续行CT扫描、记录A、B组颅骨表面钛钉间相对距离的变化,以及颅腔和脑组织大小情况。10个月后宰杀A、B、C组小尾寒羊,对比不同时期A、B组颅骨上游离钛钉和钛网上钛钉之间相对距离,对比观察A、B和C组动物行为特征、颅腔容积、脑组织重量、颅骨和脑组织镜下的显微结构的差异。(2)通过培养MC3T3-E1细胞,研究microRNA-539(miRNA-539)在成骨细胞分化发育过程中的变化规律,及其与骨的DLx2基因间的作用关系。研究方法(1)将40只1月龄的小尾寒羊分为4组,分别为实验组A1组、实验组A2组、实验组B组和对照C组。C组不做任何干预。A1组幼羊在颅骨上将钛网用四枚钛钉固定牢固,对称于矢状缝,在对侧颅骨上的相应位置将四枚游离钛钉固定牢固。A2组幼羊把钛网垂直于矢状缝固定在颅骨上,并对称性的在钛网前将四枚游离钛钉固定在颅骨上。B组则在颅骨上制作缺损面积为4×4cm的骨窗,并用钛网把缺损范围的骨窗进行覆盖,用钛钉将钛网固定于颅骨上。每个月通过CT扫描记录颅骨发育状况、游离钛钉及固定于钛网上钛钉间的距离。饲养期间观察动物行为特征,10个月后宰杀动物,测量各钛钉间的距离及动物头围,脑组织的重量、体积,选取钛网覆盖下的颅骨和脑组织标本在显微镜下观察,得到的结果与C组进行比较分析。并对相关数据进行统计分析。(2)将培养的MC3T3-E1细胞分为实验组,也称矿化组(抗坏血酸和β-甘油磷酸钠诱导)和对照组,通过real time-PCR法检测实验组和对照组不同时间点miRNA-539的丰度,通过RT-PCR法和Western Blot法检测实验组和对照组不同时间点DLx2基因调控的mRNA丰度和蛋白含量。用miRNA-539慢病毒(实验组)和空白对照慢病毒(对照组)转染的MC3T3-E1细胞在矿化诱导的培养基中培养21天,用RT-PCR法来测量miRNA-539和DLx2调控的mRNA的水平,用Western Blot法来测量DLx2调控的蛋白水平,测定两组细胞碱性磷酸酶的活性,茜素红染色来显示矿化基质的结构。结果(1)A1组:测量得到四枚游离钛钉间距离均变大,并通过测量头围指标发现矢状缝两侧颅盖骨发育相对对称;A2组:测量颅骨上四枚游离钛钉间距离明显变大,颅腔的发育没有出现畸形;与C组比较,A1、A2组幼羊的行为学表现,体重、头围指标、脑组织的体积及重量的差异均无统计学意义(p>0.05)。显微镜下提示骨缝处颅骨细胞生长较其他部位活跃。(2)B组:固定于颅骨表面的钛网与骨窗周围骨质结合牢固,在骨质缺损的范围内有骨质增生,可以看到缺损范围在缩小,增生的骨质较周围正常骨质要薄,骨板层次不清,显微镜下观察,增生骨质切片较正常对照组相比有明显的差异。(3)对照组不同时间点的miRNA-539的丰度变化无统计学意义(P>0.05),而实验组与对照组相比,各个时间段的miRNA-539丰度都显著下调(P<0.05)。DLx2基因调控的mRNA丰度和蛋白表达量在对照组内各个时间点无变化。而实验组与对照组相比,各个时间段的mRNA丰度和蛋白表达量上调显著。miRNA-539慢病毒转染的MC3T3-E1细胞中,DLx2基因的mRNA丰度和蛋白含量在下降(P<0.05)。与对照组相比,该转染阳性实验组的碱性磷酸酶的活性更低,成骨细胞的分化和矿化结节显著减少。结论(1)固定于幼羊未发育成熟颅骨钛网上的四枚钛钉在颅骨生长过程中是滑行运动的,未对颅骨和大脑的生长发育产生限制,幼羊颅骨生长部位主要位于骨缝处。(2)对发育期小羊的颅骨缺损区域进行钛网的覆盖固定处理,对大脑的生长发育和颅骨生长,不会产生限制性的影响,并且发现缺损范围内增生的骨质使缺损区域减少,但是,新生的骨组织结构特点有缺陷,可能不能有效的保护脑组织。(3)miRNA-539通过调控DLx2基因表达而抑制成骨细胞的分化和矿化。