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胃癌是世界上常见的恶性肿瘤之一,据文献统计,2012年有951600例新发胃癌病例,胃癌死亡病例则高达723100例。随着医学治疗相关研究的发展,化疗药物对胃癌的治疗效果越来越显著,但胃癌的多药耐药现象成为影响胃癌患者治疗效果的重要难题。为了解决胃癌多药耐药导致的治疗难题,研究人员进行了大量的研究。本实验室也正在开展一系列更加深入的研究工作。目前我们已建立了多株胃癌耐药细胞亚系,并应用糖蛋白组学鉴定和lnc RNA芯片,成功筛选鉴定出一系列耐药相关基因和分子。因为胃癌的多药耐药机制十分复杂,我们筛选出的耐药相关基因和分子不能完全阐明胃癌多药耐药发生发展的过程。正确的糖基化修饰方式是维持蛋白质正常生物活性的基础,糖基化修饰错误会导致糖蛋白的合成减少或功能丧失。已有多篇文献报道在多种肿瘤中糖基化修饰在多药耐药发生过程中扮演了重要角色。近期,越来越多的研究人员将目光聚焦于糖蛋白对肿瘤的影响,因此我们选取多株胃癌耐药系,通过糖蛋白捕获策略鉴定出11个表达差异明显的糖蛋白。这些糖蛋白很可能是预测胃癌多药耐药的生物标志物或者具有关键调节作用。CACNA2D1是表达差异最明显的糖蛋白之一。查阅文献,我们发现CACNA2D1主要在神经信号传导方面发挥重要作用,目前关于CACNA2D1分子及其糖基化在胃癌多药耐药中的作用及机制尚未见报道,我们将在本研究中对CACNA2D1的糖基化修饰与胃癌多药耐药的关系进行初步探讨。目的明确CACNA2D1在胃癌组织内表达及与临床预后的关系;探讨CACNA2D1表达变化对胃癌细胞耐药的作用及相关机制;研究糖基化修饰改变对CACNA2D1调节胃癌耐药功能的影响,最终初步阐明CACNA2D1作为糖蛋白参与调节胃癌多药耐药恶性表型的作用路径。方法1.免疫组织化学检测CACNA2D1在胃癌组织内的表达,并采用Kaplan-Meier方法分析CACNA2D1与胃癌患者临床预后之间的联系。2.q RT-PCR和Western-blot实验检测CACNA2D1在胃癌耐药细胞系及其亲本细胞系的表达。3.扩增和鉴定CACNA2D1正义和反义载体,并建立稳转细胞系,通过MTT方法、凋亡实验和药物泵出实验检测CACNA2D1表达改变后,对细胞功能的影响。4.扩增和鉴定CACNA2D1的糖基化位点突变载体,并建立相关稳转细胞系。通过MTT和药物泵出实验检测糖基化位点改变后,CACNA2D1的功能影响是否改变。结果1、CACNA2D1在胃癌组织中高表达与胃癌病人的预后密切相关q RT-PCR检测了16对新鲜胃癌组织及配对的癌旁组织,发现CACNA2D1在胃癌组织中的表达明显高于癌旁组织。同时,免疫组织化学检测CACNA2D1在89例胃癌和癌旁组织内表达,结果显示CACNA2D1在43例胃癌组织中呈阳性表达,表达阳性率为48.3%,明显高于配对的癌旁组织的表达阳性率13.4%(12/89)。统计学单因素分析发现CACNA2D1与胃癌患者临床预后存在联系,CACNA2D1表达阳性的胃癌患者生存期较短。(p<0.05)2、CACNA2D1在胃癌耐药细胞中的表达升高我们通过q RT-PCR和Western blot实验检测CACNA2D1在胃癌耐药细胞系SGC7901/VCR、SGC7901/ADR和其亲本细胞SGC7901中的表达水平,结果显示在胃癌耐药细胞系中,CACNA2D1的表达明显高于亲本细胞,差异具有统计学意义(P<0.05)。同时我们发现,在耐药细胞中,CACNA2D1的糖基化修饰程度要高于亲本细胞中。3、CACNA2D1可以促进胃癌细胞的耐药我们通过MTT检测细胞IC50发现在胃癌耐药细胞系中降低CACNA2D1的表达后,细胞对ADR、5-fu和CDDP等化疗药物的敏感性均明显上升;而上调亲本细胞系中CACNA2D1的表达则可以显著降低胃癌细胞对化疗药物的敏感性。流式细胞仪测定细胞凋亡结果显示,胃癌耐药细胞系中CACNA2D1表达下调后,凋亡细胞明显增多,提示下调CACNA2D1可以增强耐药细胞对5-fu的药物敏感性;反之,在亲本细胞系中上调CACNA2D1表达则可以降低胃癌细胞对5-fu的药物敏感性。同样,药物泵出实验结果显示,抑制CACNA2D1的表达后耐药细胞药物泵出能力减弱;而上调CACNA2D1,胃癌细胞对阿霉素泵出能力明显下降。4、CACNA2D1的糖基化修饰可以促进胃癌多药耐药通过基因定点突变我们成功构建了CACNA2D1糖基化位点突变载体并进行细胞转染,MTT实验结果显示,突变的CACNA2D1蛋白对药物的耐受能力明显低于野生型的CACNA2D1蛋白;药物泵出实验显示,突变的CACNA2D1蛋白药物泵出能力减弱。结论1、在配对的胃癌癌旁组织中,CACNA2D1在胃癌组织的表达水平及强度明显高于癌旁组织;统计学分析提示CACNA2D1与胃癌患者生存预后呈负相关联系。2、CACNA2D1在胃癌耐药细胞系中的表达明显高于亲本细胞,且以高糖基化形式存在。3、上调胃癌细胞中CACNA2D1的表达可以通过改变药物泵出,从而明显促进耐药表型的产生。4、同野生型CACNA2D1相比,降低其糖基化修饰水平可明显抑制CACNA2D1对胃癌细胞耐药的促进作用,提示糖基化修饰在CACNA2D1调控胃癌耐药过程中发挥了关键作用。