研究背景及目的:骨感染是骨折及骨科手术最常见而严重的并发症之一,常常导致过度的骨质破坏和骨不连,造成骨折不愈合或延迟愈合。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是造成骨感染的主要致病菌,约占创伤性骨髓炎检出致病菌的65%~70%。金黄色葡萄球菌细菌壁广泛存在着金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA),可以自由分泌到细胞外环境中,能广泛结合宿主防御蛋白,改变宿主免疫反应。破骨细胞由造血干细胞系髓系单核细胞分化而来,是人体骨骼系统中唯一具有吸收和重塑骨骼形态的生理性多核巨细胞。它与成骨细胞是参与骨重建的主要细胞,二者共同调节骨组织代谢的动态平衡。在感染状态下,急、慢性的炎症刺激可以改变这种动态平衡,影响骨愈合。过往研究认为,金黄色葡萄球菌A蛋白可通过多种方式降低成骨细胞活性,抑制成骨过程,是导致骨不连的重要原因。另外,破骨细胞与过度的骨质丢失现象密切相关,其分化过程受多种因素调节。然而,有关金黄色葡萄球菌A蛋白对破骨细胞形成影响及分子机制的研究鲜有报道。因此,课题组将通过:1.观察慢性创伤性骨髓炎中金黄色葡萄球菌对骨量及破骨细胞的影响;2.观察SPA对破骨细胞分化、融合及功能的影响;3.探索SPA影响破骨细胞的具体分子机制;为此类疾病的预防及治疗找寻新的靶点。实验方法:第一部分:临床样本观察金葡菌感染对骨量及破骨细胞的影响1.收取临床上明确诊断为慢性创伤性骨髓炎患者的病理样本,术中取样。2.以4%甲醛固定,10%EDTA脱钙后,石蜡包埋,制作石蜡切片。3.以Masson、HE和TRAP染色观察骨组织及破骨细胞情况。第二部分:体外实验研究SPA对破骨细胞形成的影响1.以小鼠单核巨噬细胞系(RAW264.7)体外培养,在RANKL和M-CSF的作用下建立破骨细胞诱导模型。2.以不同浓度梯度的SPA与细胞培养,以CCK8实验检测其对细胞增殖毒性的影响,确定实验的安全浓度。3.按照实验设置的分组,将不同浓度梯度的SPA与细胞培养,设置对照,诱导三天后以抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色试剂盒染色,观察破骨细胞形成的数量;4.以黏着斑(FAK)染色观察破骨细胞的形态及融合情况;5.以骨吸收陷窝实验观察SPA对破骨细胞骨吸收功能的影响;6.细胞流式技术检测SPA对细胞早期和晚期凋亡的影响;第三部分:SPA促进破骨细胞形成的机制研究1.以RT-PCR技术检测破骨细胞形成相关的m RNA表达量变化;2.Westernblot技术检测NFATC1、c-FOS及其上游MAPK通路相关蛋白的表达量变化。3.阻断MAPK通路,Western blot技术检测NFATC1、c-FOS表达量变化。实验结果:一、金黄色葡萄球菌所致慢性创伤性骨髓炎患者的感染部位的骨小梁较非感染组明显变薄,破骨细胞处于明显激活状态。二、SPA促进了破骨细胞分化、融合,增强了其骨吸收功能。1.RAW264.7细胞在50ng/ml的RANKL和50ng/ml的M-CSF作用下诱导三天,我们建立了稳定的破骨细胞体外诱导培养体系。2.本研究首先以不同浓度梯度的SPA与RAW264.7细胞共同培养,CCK8实验结果显示SPA浓度在1000μg/ml时吸光度值显著下降。流式分析的结果显示SPA对细胞的早期及晚期凋亡均无影响。3.根据CCK8实验结果,将各个实验分组的SPA浓度设置在安全范围之内,即0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml。TRAP染色结果显示破骨细胞(细胞核>3核)的细胞数量较对照组明显增多。4.FAK染色结果显示实验组较对照组破骨细胞的数量及平均核数均明显增加。5.骨吸收陷窝实验结果显示各实验组的骨吸收陷窝较对照组明显增加。三、qPCR结果显示实验组CTSK、TRAP、CTR、DC-STAMP等破骨细胞形成相关基因表达明显上调。Western blot检测NFATC1、c-FOS等转录因子的表达明显上调。MAPK通路的ERK、JNK、P38的磷酸化水平即p-ERK、p-JNK、p-P38的表达量均明显增加。同时,上述通路被阻断后NFATC1、c-FOS的表达水平降低。结论:金黄色葡萄球菌导致的骨感染中骨丢失加剧、破骨细胞处于过度激活状态。金黄色葡萄球菌A蛋白作为主要抗原成分,它能够促进破骨细胞分化、融合,促使骨吸收功能增加。SPA通过激活MAPK通路促使其下游NFATc1、c-FOS表达上调,促使破骨细胞形成。我们的研究结果有助于更好的理解金黄色葡萄球菌在骨感染中的致病作用,对于治疗此类疾病具有重要的意义。