论文部分内容阅读
目的:明确血小板源性生长因子(Platelet drivde growthfactor BB,PDGF-BB)和cGMP依赖的蛋白激酶Iα(cGMP dependentprotein kinase Iα,PKGIα)对血管平滑肌细胞(Vascular smoothmuscle cell,VSMC)形态和骨架的影响,以及对VSMC表型转变的调节,尤其是对合成型标志基因表达的影响。
方法:(1)通过位置特异性重组构建携带PKGIα基因的复制缺陷型腺病毒pAd-PKGIα,并进行病毒滴定测定;(2)采用组织块贴壁法原代培养大鼠主动脉平滑肌细胞(Rat aortic somooth musclecells,RASMCs);(3)通过RT-PCR方法检测正常培养的RASMCs和大鼠胸主动脉平滑肌细胞株CS-54细胞感染pAd-PKGIα后PKGIα的表达;通过western-blotting方法检测cGMP的类似物8-APT-cGMP对PKGIα的激活作用;(4)光学显微镜观察PDGF-BB和PKGIα对RASMCs和CS-54细胞形态的影响;(5)免疫荧光法观察PDGF-BB和PKGIα对RASMCs和CS-54细胞骨架的影响;(6)Real-time PCR法从基因水平检测PDGF-BB和PKGIα对CS-54细胞合成型代表基因表达的影响;(7)Western blotting法从蛋白水平检测PDGF-BB和PKGIα对CS-54细胞合成型代表基因表达的影响。
结果:(1)构建的pAd-PKGIα通过大量复制和纯化,获得滴度约5×1010pfu/ml。对照病毒pAd-LacZ经扩增、纯化,获得滴度为7.5×1010pfu/m1。最佳转染复数为MOl=100;(2)植块法进行原代培养的细胞经形态学和免疫荧光鉴定证实为VSMC;(3)构建的pAd-PKGIα感染RASMCs和CS-54细胞后,PKGIα的表达明显增多,证实pAd-PKGIα成功感染。通过Western blotting方法证明8-APT-cGMP可以激活PKGIα;(4)PDGF-BB对RASMCs和CS-54细胞的形态和骨架均有影响,这种影响可由PKGIα表达和活性的增加而逆转;(5)PDGF-BB可使CS-54细胞合成型代表基因Epiregul in表达增高,PKGIα和8-APT-cGMP共同作用可逆转这个变化过程,使Epiregul in的表达恢复至对照组水平。而其他合成型代表基因如OPN和MMP2没有类似的变化。
结论:PDGF-BB可使VSMC形态和骨架发生明显改变,由收缩表型细胞去分化为合成表型细胞。PKGIα和8-APT-cGMP可逆转已经发生的去分化变化,使细胞形态和骨架恢复至原有的状态。PDGF-BB能够增高合成型标志基因Epiregulin的表达水平,且其表达同样可以被PKGIα和8-APT-cGMP下调至对照组水平。另外两种合成型标志基因OPN和MMP2不存在这样的改变。