论文部分内容阅读
研究背景:甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤之一,已成为国际上发病率增长最快的实体瘤。临床上用于甲状腺癌早期筛查的指标极为匮乏,亟待寻找新的分子标志物。大量研究发现生物节律基因在大肠癌、乳腺癌等肿瘤的发生及进展中发挥着重要作用。其中CLOCK、BMAL1、NPAS2三种生物节律基因的蛋白产物组成正性调控元件,驱动生物节律的产生,并通过调控下游c-Myc、P53、P21等大量钟控基因参与肿瘤细胞增殖、侵袭、转移等重要功能,但生物节律基因在甲状腺癌领域的研究较少。课题组前期通过免疫组化预实验,发现甲状腺乳头状癌组织中CLOCK基因表达升高。这些提示我们CLOCK基因在甲状腺癌的发生及进展中可能发挥重要作用,但其生物学作用及分子机制尚不清楚。目的:利用CLOCK基因siRNA干涉片段,下调甲状腺癌细胞中CLOCK基因表达水平,分析干涉后甲状腺癌细胞的生物学功能变化。并检测P21、P53、CyclinD1等钟控基因的表达变化,初步探讨CLOCK基因参与甲状腺癌发生及进展的分子作用机制。方法:常规培养甲状腺癌细胞株BCPAP,常规培养。根据CLOCK基因设计特异性的siRNA,利用Lipofecter 2000试剂转染BCPAP细胞,将甲状腺癌细胞株分为空白对照组(KD组),转染试剂对照组(ZD组),单纯siRNA对照组(SD),阴性对照组(YD组)和干涉组(GS组)5组。给予不同处理,利用Western Blot检测干涉效率,CCK8实验检测细胞增殖能力,粘附实验检测细胞粘附能力,流式细胞仪检测细胞凋亡程度,Transwell侵袭实验评估侵袭与转移能力。并通过Western Blot检测P21、P53、CyclinD1等分子在干涉CLOCK基因后的表达变化。结果:1.干涉组(GS组)BCPAP细胞增殖能力较空白对照组(GD组)降低(P<0.05)。ZD组、SD组、YD组与GD组比无明显改变(P>0.05)。2.干涉组(GS组)BCPAP细胞凋亡较空白对照组(GD组)增多(P<0.05)。ZD组、SD组、YD组与GD组比无明显改变(P>0.05)。3.干涉组(GS组)BCPAP细胞粘附能力较空白对照组(GD组)减低(P<0.05)。ZD组、SD组、YD组与GD组比无明显改变(P>0.05)。4.干涉组(GS组)BCPAP迁移及侵袭细胞数较空白对照组(GD组)减少(P<0.05)。ZD组、SD组、YD组与GD组比无明显改变(P>0.05)。5.P21、P53蛋白在干涉组(GS组)较空白对照组(GD组)升高(P<0.05),CyclinD1蛋白在干涉组(GS组)较空白对照组(GD组)降低(P<0.05)。结论:1.下调CLOCK基因的表达可以促进甲状腺癌细胞凋亡,抑制甲状腺癌细胞增殖、浸润及转移。2.CLOCK基因可能是通过调控甲状腺癌细胞中P21、P53和CyclinD1重要基因的表达,参与甲状腺癌的发生及进展。